ROZPORZĄDZENIE

MINISTRA ROLNICTWA I ROZWOJU WSI¹⁾

z dnia 23 stycznia 2003 r.

w sprawie metodyki postępowania analitycznego w zakresie określania zawartości składników pokarmowych i dodatków paszowych w materiałach paszowych, premiksach i mieszankach paszowych

(Dz. U. z dnia 17 kwietnia 2003 r.)

Na podstawie art. 44 ust. 7 pkt 2 ustawy z dnia 23 sierpnia 2001 r. o środkach żywienia zwierząt (Dz. U. Nr 123, poz. 1350) zarządza się, co następuje:

§ 1. Ustala się metodykę postępowania analitycznego w zakresie określania zawartości składników pokarmowych i dodatków paszowych w materiałach paszowych, premiksach i mieszankach paszowych, stanowiącą załącznik do rozporządzenia.

§ 2. Rozporządzenie wchodzi w życie po upływie 14 dni od dnia ogłoszenia.

________

¹⁾   Minister Rolnictwa i Rozwoju Wsi kieruje działem administracji rządowej - rolnictwo, na podstawie § 1 ust. 2 pkt 1 rozporządzenia Prezesa Rady Ministrów z dnia 29 marca 2002 r. w sprawie szczegółowego zakresu działania Ministra Rolnictwa i Rozwoju Wsi (Dz. U. Nr 32, poz. 305).

(Załącznik do rozporządzenia stanowi oddzielny załącznik do niniejszego numeru)

..................................................

Notka Redakcji Systemu Informacji Prawnej LEX

Grafiki zostały zamieszczone wyłącznie w Internecie. Obejrzenie grafik podczas pracy z programem Lex wymaga dostępu do Internetu.

..................................................

ZAŁĄCZNIK

METODYKA POSTĘPOWANIA ANALITYCZNEGO W ZAKRESIE OKREŚLANIA ZAWARTOŚCI SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH I DODATKÓW PASZOWYCH W MATERIAŁACH PASZOWYCH, PREMIKSACH I MIESZANKACH PASZOWYCH

SPIS TREŚCI

ROZDZIAŁ 1.      Przygotowanie próbek do badań

ROZDZIAŁ 2.      Badanie podstawowych składników pokarmowych

2.1.   Oznaczanie białka surowego metodą Kjeldahla

2.2.   Oznaczanie zawartości azotu rozpuszczalnego po traktowaniu pepsyną w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym

2.2.1.  Oznaczanie aktywności pepsyny

2.3.   Oznaczanie wilgotności

2.4.   Oznaczanie wilgotności olejów i tłuszczów

2.5.   Oznaczanie popiołu surowego

2.6.   Oznaczanie popiołu nierozpuszczalnego w kwasie chlorowodorowym

2.7.   Oznaczanie włókna surowego

2.8.   Oznaczanie surowego oleju i tłuszczu

2.9.   Oznaczanie skrobi metodą polarymetryczną

2.10.  Oznaczanie skrobi metodą pankreatynową

2.11.  Oznaczanie cukrów

2.12.  Oznaczanie laktozy

ROZDZIAŁ 3.      Badanie aminokwasów

3.1.   Oznaczanie aminokwasów

3.2.   Oznaczanie tryptofanu

3.3.   Oznaczanie dostępnej lizyny

ROZDZIAŁ 4.      Badanie składników mineralnych

4.1.   Oznaczanie wapnia

4.2.   Oznaczanie sodu

4.3.   Oznaczanie potasu

4.4.   Oznaczanie chlorków

4.5.   Oznaczanie magnezu

4.6.   Oznaczanie całkowitej zawartości fosforu metodą fotometryczną

4.7.   Oznaczanie żelaza, miedzi, manganu i cynku

4.8.   Oznaczanie węglanów

4.9.   Oznaczanie zawartości wapnia, miedzi, żelaza, magnezu, manganu, potasu, sodu i cynku metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej

4.10.  Oznaczanie selenu

ROZDZIAŁ 5.      Badanie witamin

5.1.   Oznaczanie witaminy A metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

5.2.   Oznaczanie witaminy E metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

5.3.   Oznaczanie menadionu (witamina K₃)

5.4.   Oznaczanie tiaminy (witamina B₁)

5.5.   Oznaczanie kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego (witamina C)

ROZDZIAŁ 6.      Badanie stymulatorów wzrostu

6.1.   Oznaczanie wirginiamycyny metodą dyfuzji w żelu agarowym

6.2.   Oznaczanie Zn-bacytracyny metodą dyfuzji w żelu agarowym

6.3.   Oznaczanie flawomycyny metodą dyfuzji w żelu agarowym

6.4.   Oznaczanie spiramycyny metodą dyfuzji w żelu agarowym

6.5.   Oznaczanie awoparcyny metodą dyfuzji w żelu agarowym

6.6.   Oznaczanie soli sodowej monenzyny metodą dyfuzji w żelu agarowym

6.7.   Oznaczanie soli sodowej lasalocidu metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

6.8.   Oznaczanie zawartości soli sodowej salinomycyny metodą mikrobiologiczną

6.9.   Oznaczanie zawartości tylozyny metodą mikrobiologiczną

ROZDZIAŁ 7.      Badanie kokcydiostatyków i innych środków farmaceutycznych

7.1.   Oznaczanie etopabatu

7.2.   Oznaczanie metylobenzoquatu

7.3.   Oznaczanie nikarbazyny

7.4.   Oznaczanie halofuginonu

7.5.   Oznaczanie dinitolmidu (DOT)

7.6.   Oznaczanie robenidyny

7.7.   Oznaczanie amprolium

7.8.   Oznaczanie buchinolanu

7.9.   Oznaczanie sulfochinoksaliny

7.10.  Oznaczanie furazolidonu

7.11.  Oznaczanie amprolium metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

7.12.  Oznaczanie diklazurilu

7.13.  Oznaczanie karbadoksu

7.14.  Oznaczanie olaquindoksu

7.15.  Oznaczanie zawartości narazyny metodą mikrobiologiczną

7.16.  Oznaczanie klopidolu

7.17.  Oznaczanie maduramycyny (Cygro)

ROZDZIAŁ 8.      Badanie substancji i materiałów niepożądanych i szkodliwych

8.1.   Oznaczanie aflatoksyny B₁ metodą jednokierunkowej chromatografii cienkowarstwowej

8.2.   Oznaczanie aflatoksyny B₁ metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej

8.3.   Oznaczanie teobrominy

8.4.   Oznaczanie olejku gorczycznego

8.5.   Oznaczanie kwasu cyjanowodorowego

8.6.   Oznaczanie zawartości alkaloidów w łubinie

8.7.   Szacowanie aktywności ureazy w produktach sojowych

8.8.   Oznaczanie gossypolu

8.9.   Wytyczne do mikroskopowej identyfikacji i oznaczania składników pochodzenia zwierzęcego

8.10.  Oznaczanie lotnych związków azotowych

8.11.  Oznaczanie aktywności inhibitora trypsyny w produktach sojowych

ROZDZIAŁ 9.      Badanie innych składników i dodatków paszowych

9.1.   Ilościowe oznaczanie chudego mleka w proszku w mieszankach paszowych przez enzymatyczną koagulację parakazeiny

9.2.   Oznaczanie podpuszczkowej serwatki w proszku w chudym mleku w proszku i w mieszaninach

9.3.   Wykrywanie skrobi w chudym mleku w proszku, denaturowanym mleku w proszku i w mieszankach paszowych

9.4.   Oznaczanie wilgotności kwasowej maślanki w proszku

9.5.   Oznaczanie BHT, BHA i EQ

Rozdział 1

PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO BADAŃ

1. POSTANOWIENIA OGÓLNE

Wszystkie konieczne czynności powinny być wykonywane w taki sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zmianie składu próbki. Rozdrabnianie, mieszanie, przesiewanie powinno być wykonywane możliwie szybko, przy ograniczonym dostępie powietrza i światła do próbki. Młynki i rozdrabniacze powodujące nagrzewanie próbki podczas pracy nie powinny być stosowane. W przypadku środków żywienia zwierząt szczególnie wrażliwych na ciepło należy zalecać ręczne rozdrabnianie. Należy ponadto zwrócić uwagę, czy zastosowany sprzęt nie stanowi źródła zanieczyszczenia środka żywienia zwierząt pierwiastkami śladowymi.

1.1. Wymagania związane z odczynnikami i stosowaną aparaturą w metodyce postępowania analitycznego

1.1.1. Jeżeli nie zaznaczono inaczej w metodzie analizy, wszystkie stosowane odczynniki powinny posiadać stopień czystości do analizy - cz.d.a. W przypadku oznaczania pierwiastków śladowych, czystość odczynników musi być sprawdzana przez wykonywanie ślepej próby. Zależnie od uzyskanych wyników, dalsze oczyszczanie odczynników może być konieczne.

1.1.2. Wszystkie czynności wymagające przygotowania roztworów, rozcieńczanie, spłukiwanie lub przemywanie wykazywane w metodach analizy bez podawania nazwy stosowanego rozpuszczalnika, odnoszą się do wody. Jako podstawową należy przyjąć zasadę, że stosowana woda powinna być destylowana lub dejonizowana. W szczególnych przypadkach, wymienianych w metodach oznaczania, mogą być zalecane specjalne sposoby oczyszczania wody.

1.1.3. W laboratorium należy stosować urządzenia lub aparaty, których stosowanie jest zalecane w metodyce postępowania analitycznego. Urządzenia te powinny być czyste zwłaszcza wtedy, gdy oznaczane są bardzo małe ilości substancji.

1.2. Stosowanie metod analizy i wyrażanie wyników

1.2.1. Generalnie jedna metoda oznaczania jest zalecana do analizy każdej substancji w środku żywienia zwierząt. Gdy funkcjonuje kilka metod oznaczania tej samej substancji, metoda, przy użyciu której wykonywano oznaczenie, powinna być wymieniona w sprawozdaniu z badań.

1.2.2. Wynik podany w sprawozdaniu z badań powinien stanowić średnią wartość, z co najmniej dwóch oznaczeń, o zadowalającej dokładności, wykonanych z tej samej próbki do badań.

1.2.3. Wynik powinien być wyrażony w sposób podany w metodzie oznaczania, zawierać odpowiednią liczbę cyfr znaczących i, jeśli to konieczne, powinien być odniesiony do średniej próbki laboratoryjnej przed przygotowaniem.

2. CEL I ZAKRES

W rozdziale opisano metodę przygotowania próbek do badań z średniej próbki laboratoryjnej, w tym karmy dla zwierząt domowych.

Opisane postępowanie dotyczy przygotowania do analizy średniej próbki laboratoryjnej, dostarczonej do upoważnionego laboratorium.

Objaśnienia:

Próbka do badań - reprezentatywna część średniej próbki laboratoryjnej, otrzymana przez podzielenie za pomocą rozdzielacza lub ręcznie i, jeśli konieczne, po rozdrobnieniu,

Próbka analityczna - reprezentatywna część próbki do badań lub średniej próbki laboratoryjnej.

3. ZASADA METODY

W przypadku środków żywienia zwierząt w postaci stałej, średnia próbka laboratoryjna jest dokładnie mieszana i dzielona, zgodnie z odrębnymi przepisami, aż do otrzymania próbki do badań o odpowiedniej masie. Stosowany jest proces kruszenia, rozdrabniania, siekania lub homogenizacji, w zależności od potrzeby, dający pewność, że próbka do badań, z której będzie pobrana próbka analityczna, reprezentuje rzeczywiście średnią próbkę laboratoryjną. W przypadku środków żywienia zwierząt w postaci płynnej albo półpłynnej, średnia próbka laboratoryjna jest mieszana mechanicznie, a w trakcie jej mieszania jest pobierana reprezentatywna próbka do badań.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Młynek mechaniczny, łatwy do czyszczenia i umożliwiający rozdrabnianie środka żywienia zwierząt bez wytwarzania nadmiaru ciepła i niepowodujący zmian w wilgotności podczas przechodzenia próbki przez sito o odpowiedniej wielkości oczek (4.5).

Niektóre środki żywienia zwierząt tracą lub pobierają wilgoć. W takich przypadkach konieczne jest zastosowanie współczynnika korygującego przy obliczaniu wyników ((5.2) i (6)).

Nie jest wymagane, aby rozmiary siatki w młynku były takie same jak w sicie do badania stopnia rozdrobnienia.

4.2. Mieszadło mechaniczne lub homogenizator

4.3. Maszynka do mięsa, wyposażona w siatkę 4 mm

4.4. Kruszarka, na przykład pistel i moździerz

4.5. Sita, o wymiarach otworów 1,00 mm, 2,80 mm i 4,00 mm, z drutu

4.6. Aparat rozdzielający lub przyrząd dzielący na ćwiartki (krzyżak), taki jak rozdzielacz stożkowy (rys. 1), rozdzielacz wieloszczelinowy z systemem sortującym (rys. 2) lub inny rozdzielacz, który zapewni jednakowy rozkład składników średniej próbki laboratoryjnej w próbce do badań.

4.7. Pojemnik na próbki, odpowiedni do ochrony próbki przed zmianą składu, chroniący przed światłem i takiej wielkości, aby był prawie całkowicie wypełniony próbką. Istotne jest, aby pojemnik mógł być dokładnie zamykany.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Ważne jest podjęcie takich zabezpieczeń, aby zastosowany sprzęt nie stanowił źródła zanieczyszczeń.

5.1. Rozdrabnianie

5.1.1. Zasada ogólna

Rozdrabnianie niektórych próbek do badań może prowadzić do strat lub wzrostu wilgoci i stosowne zmiany powinny być uwzględnione (5.2 i Rozdział 5). Zaleca się rozdrabnianie przeprowadzić możliwie szybko, ograniczając do minimum ekspozycję próbki na działanie atmosfery. Jeśli to konieczne, rozbić lub rozkruszyć kawałki materiału do wymiarów odpowiednich do mielenia. Ważne jest, aby próbka analityczna była dokładnie mieszana przed każdym etapem postępowania.

5.1.2. Próbki drobnoziarniste

Jeśli średnia próbka laboratoryjna przesiewa się całkowicie przez sito 1,00 mm (4.5), dokładnie ją wymieszać. Rozdzielić materiał za pomocą rozdzielacza lub krzyżaka (4.6) aż do otrzymania odpowiedniej wielkości próbki do badań (5.9).

5.1.3. Próbki średnioziarniste

5.1.3.1. Jeśli średnia próbka laboratoryjna nie przesiewa się całkowicie przez sito 1,00 mm (4.5), lecz przesiewa się całkowicie przez sito 2,80 mm, dokładnie ją wymieszać i przygotować próbkę do badań o odpowiedniej masie (5.9) przez odpowiednie rozdzielenie, jak w (5.1.2).

5.1.3.2. Ostrożnie rozdrobnić próbkę do badań w dobrze oczyszczonym młynku (4.1), jak podano w (5.1.1), aż przesieje się całkowicie przez sito 1,00 mm.

5.1.4. Próbki gruboziarniste

5.1.4.1. Jeśli średnia próbka laboratoryjna nie przesiewa się całkowicie przez sito 2,80 mm (4.5), należy ostrożnie rozdrobnić ją w dobrze oczyszczonym młynku (4.1), aż przesieje się całkowicie przez sito 2,80 mm. Dokładnie wymieszać.

5.1.4.2. Rozdzielić rozdrobnioną średnią próbkę laboratoryjną za pomocą urządzenia do rozdzielania próbek (4.6) aż do otrzymania próbki do badań o odpowiedniej masie (5.9) do przeprowadzenia wszystkich wymaganych oznaczeń. Rozdrobnić tę próbkę w dobrze oczyszczonym młynku (4.1), aż przesieje się całkowicie przez sito 1,00 mm (4.5).

5.2. Próbki mogące tracić lub chłonąć wilgoć

Jeżeli w wyniku rozdrabniania następują straty lub wzrost wilgoci w próbce, oznaczyć wilgotność metodą podaną w (Rozdział 2, 2.3). Oznaczanie przeprowadzić w otrzymanej, dobrze wymieszanej średniej próbce laboratoryjnej i w przygotowanej próbce do badań tak, aby wyniki analiz mogły być skorygowane co do zawartości wilgoci w odniesieniu do średniej próbki laboratoryjnej otrzymanej w oryginalnym stanie (6).

5.3. Próbki trudne do rozdrabniania

Jeżeli średnia próbka laboratoryjna nie przesiewa się przez sito 1,00 mm (4.5) i jest trudna do rozdrobnienia, pobrać część próbki tuż po odpowiednim wymieszaniu opisanym w (5.1.3.1) lub po wstępnym rozdrobnieniu opisanym w (4.1.4.1).

Oznaczyć wilgotność metodą podaną w (Rozdział 2, 2.3). Suszyć próbkę po uprzednim rozkruszeniu w moździerzu (4.4) lub w inny sposób, aż przesieje się całkowicie przez sito 1,00 mm. Oznaczyć znowu wilgotność w przygotowanej próbce do badań tak, aby wyniki analiz mogły być skorygowane co do zawartości wilgoci w odniesieniu do średniej próbki laboratoryjnej otrzymanej w oryginalnym stanie (6).

5.4. Pasze mokre, takie jak karma puszkowana lub schłodzona dla zwierząt domowych

Homogenizować średnią próbkę laboratoryjną (stanowiącą zawartość puszki lub innego opakowania), stosując mieszadło mechaniczne lub homogenizator (4.2). Dokładnie wymieszać rozdrobnioną próbkę. Umieścić w suchym i czystym pojemniku (4.7) i szczelnie zamknąć. Pobierać próbki analityczne możliwie szybko, najlepiej natychmiast. Przechowywać próbkę do badań w temperaturze od 0°C do 4°C.

5.5. Pasze mrożone

Pociąć lub rozbić średnią próbkę laboratoryjną na małe kawałki za pomocą odpowiednich narzędzi. Rozdrobnić szybko kawałki za pomocą maszynki do mięsa (4.3). Wymieszać rozdrobnioną próbkę do badań tak, aby wszelkie resztki cieczy rozprowadzić równomiernie w próbce. Umieścić w suchym i czystym pojemniku (4.7) i szczelnie zaniknąć. Pobierać próbki analityczne możliwie szybko, najlepiej natychmiast. Przechowywać próbkę do badań w temperaturze od 0°C do 4°C.

5.6. Pasze o pośredniej wilgotności

Rozdrobnić średnią próbkę laboratoryjną za pomocą maszynki do mięsa (4.3). Dokładnie wymieszać i szybko przepuścić przez sito 4 mm (4.5). Próbkę do badań umieścić w suchym i czystym pojemniku (4.7) i szczelnie zamknąć.

Jeśli natura próbki nie pozwala na jej rozdrobnienie za pomocą maszynki do mięsa, wymieszać i rozdrobnić ją ręcznie tak dokładnie jak to możliwe.

5.7. Próbki kiszonek i cieczy

5.7.1. Kiszonka z traw lub zbóż

Rozdrobnić średnią próbkę laboratoryjną, jeśli to możliwe, za pomocą młynka mechanicznego (4.1) lub dokładnie pociąć.

Dokładnie wymieszać i przenieść próbkę do badań o masie co najmniej 100 g do pojemnika na próbki (4.7).

Jeśli średnia próbka laboratoryjna nie może być rozdrobniona za pomocą młynka lub nie może być dokładnie pocięta, należy ją dokładnie wymieszać i oznaczyć wilgotność metodą podaną w (Rozdział 2, 2.3). Suszyć średnią próbkę laboratoryjną (na przykład przez całą noc w temperaturze od 60°C do 70°C, w suszarce elektrycznej z wentylacją) i następnie rozdrobnić za pomocą młynka (4.1). Dokładnie wymieszać i przenieść próbkę do badań o masie co najmniej 100 g do pojemnika (4.7).

Oznaczyć wilgotność tak przygotowanej próbki do badań metodą podaną w (Rozdział 2, 2.3) i zastosować do korekty wszystkich wyników (6).

5.7.2. Ciekłe próbki łącznie z kiszonką rybną

Wymieszać średnią próbkę laboratoryjną, stosując mechaniczne mieszadło lub homogenizator (4.2), tak aby widoczne odrębne fragmenty materiału (kości, olej itp.) były dokładnie rozproszone. Mieszając, przenieść 50 ml do 100 ml cieczy do pojemnika na próbki (4.7), używając do tego celu czerpaka, zlewki lub pipety z szerokim otworem.

5.8. Próbki o specjalnych wymaganiach

Niektóre analizy mogą wymagać specjalnego przygotowania próbek. Specyficzne wymagania opisano w odpowiedniej części metody badania.

Dla przeprowadzenia oznaczeń wymagających wyższego stopnia rozdrobnienia, może być potrzebne dalsze rozdrabnianie.

W takich przypadkach należy przygotować próbkę do badań, jak opisano w ((5.1), (5,2) lub (5.3)), lecz o wymaganym stopniu rozdrobnienia.

W niektórych przypadkach może być konieczne zapobieganie rozkruszeniu lub uszkodzeniu średniej próbki laboratoryjnej, na przykład przy oznaczaniu twardości granulatu.

Jeśli średnia próbka laboratoryjna jest niejednorodna, na przykład przy takich analizach jak mikotoksyny lub dodatki lecznicze, może być konieczne rozdrobnienie całej próbki do badań, a następnie zmniejszenie jej rozmiarów do odpowiedniej próbki analitycznej.

Jeżeli średnia próbka laboratoryjna jest tłusta, próbka do badań może być przygotowana przez podgrzanie i mieszanie.

W niektórych przypadkach może być konieczna wstępna ekstrakcja tłuszczu. Można to przeprowadzić metodą podaną w (Rozdział 2, 2.8).

Jeśli przewidywane jest badanie mikrobiologiczne, postępowanie z średnią próbką laboratoryjną należy prowadzić w sterylnych warunkach i w taki sposób, aby warunki mikrobiologiczne tej próbki nie uległy zmianie.

5.9. Wielkość i przechowywanie próbki do badań

Przygotować wystarczającą ilość próbki do badań dla wszystkich przewidywanych oznaczeń, ale nie mniej niż 100 g.

Wypełnić wybrany pojemnik (4.7) bez zwłoki i dokładnie zamknąć.

Przechowywać próbkę do badań w takich warunkach, aby zredukować zmiany do minimum, zwracając szczególną uwagę na ochronę tych próbek przed działaniem światła i temperatury.

6. OBLICZANIE WSPÓŁCZYNNIKA KOREKCYJNEGO

6.1. Zasada generalna

Jeżeli podczas rozdrabniania próbka traci lub chłonie wilgoć, konieczne jest zastosowanie współczynnika korekcyjnego, aby odnieść wyniki analiz co do zawartości wilgoci do próbki otrzymanej w oryginalnym stanie. Podobny sposób stosuje się, jeżeli przeprowadzona zostanie wstępna ekstrakcja tłuszczu.

6.2. Obliczyć współczynnik korekcyjny ¦ według równania:

   100% - w₀

¦ _{= ----------}

   100% - w₁

w którym:

¦ -   jest współczynnikiem korekcyjnym;

w₀ -  jest zawartością wilgoci w próbce laboratoryjnej, oznaczoną metodą podaną w (Rozdział 2, 2.3), wyrażoną w procentach;

w₁ -  jest zawartością wilgoci w próbce do badań, oznaczoną metodą podaną w (Rozdział 2, 2.3), wyrażoną w procentach.

6.3. Korekta wyników

Pomnożyć wyniki analiz przez współczynnik korekcyjny ¦.

Przykłady urządzeń do rozdzielania próbek

grafika

Klucz

1 Pojemnik

2 Szyber

3 Przestrzenie, które otwierają się do zewnętrznego leja

4 Przewody, które prowadzą do wewnętrznego leja

5 Wewnętrzny lej

6 Zewnętrzny lej

7 Odbieralnik

8 Podstawa stożka

9 Wierzchołek stożka

10 Przewody złączone poniżej podstawy stożka

Rozdzielacz stożkowy

rys. 1 Rozdzielacz stożkowy

grafika

Rozdzielacz wieloszczelinowy z systemem sortującym

rys. 2 Rozdzielacz wieloszczelinowy z systemem sortującym

Rozdział 2

BADANIE PODSTAWOWYCH SKŁADNIKÓW POKARMOWYCH

2.1. OZNACZANIE BIAŁKA SUROWEGO METODĄ KJELDAHLA

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości białka surowego w paszach na podstawie zawartości azotu oznaczonego metodą Kjeldahla.

2. ZASADA METODY

Próbka jest mineralizowana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Kwaśny roztwór jest alkalizowany za pomocą wodorotlenku sodu. Amoniak oddestylowany z zasadowego roztworu jest zbierany w znanej ilości roztworu kwasu siarkowego, którego nadmiar jest z kolei miareczkowany roztworem wodorotlenku sodu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Siarczan potasu

3.2. Katalizator: tlenek miedzi(II) CuO lub siarczan miedzi(II) CuSO₄ x 5H₂O pentahydrat

3.3. Granulowany cynk

3.4. Kwas siarkowy, d = 1,84 g/cm³

3.5. Kwas siarkowy c(1/2 H₂SO₄) = 0,5 mol/l

3.6. Kwas siarkowy c(1/2 H₂SO₄) = 0,1 mol/l

3.7. Czerwień metylowa, wskaźnik; rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu, 95 - 96% (V/V)

3.8. Wodorotlenek sodu (może być o czystości technicznej), roztwór o stężeniu 40 g /100 ml (m/V: 40%)

3.9. Wodorotlenek sodu, roztwór o stężeniu c = 0,25 mol/l

3.10. Wodorotlenek sodu, roztwór o stężeniu c = 0,1 mol/l

3.11. Granulowany pumeks, przemyty kwasem solnym i wyprażony

3.12. Acetanilid (t.t. = 114°C, N = 10,36%)

3.13. Sacharoza (niezawierająca azotu)

4. APARATURA I SPRZĘT

Aparatura i sprzęt odpowiedni do przeprowadzenia mineralizacji, destylacji i miareczkowania według metody Kjeldahla.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Mineralizacja

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1g próbki i przenieść do kolby aparatu do mineralizacji. Dodać 15 g siarczanu potasu (3.1), odpowiednią ilość katalizatora (3.2) (0,3 do 0,4 g tlenku miedzi(II) lub 0,9 do 1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi(II)), 25 ml kwasu siarkowego (3.4), kilka granul pumeksu (3.11) i zamieszać. Początkowo ogrzewać kolbę ostrożnie, w razie konieczności mieszając od czasu do czasu, aż do zwęglenia organicznego materiału i zaniku piany; następnie zwiększyć intensywność ogrzewania aż do trwałego wrzenia roztworu. Ogrzewanie jest właściwe, jeżeli wrzący kwas kondensuje na ściankach kolby. Należy zapobiegać miejscowemu przegrzewaniu się materiału i przylepianiu organicznych cząstek do tych miejsc. Od chwili, gdy roztwór stanie się klarowny i przyjmie jasnozieloną barwę, należy kontynuować ogrzewanie przez dwie godziny, a następnie pozostawić celem schłodzenia.

5.2. Destylacja

Ostrożnie dodać do kolby ilość wody wystarczającą do całkowitego rozpuszczenia siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie dodać kilka granulek cynku (3.3).

Umieścić w odbieralniku aparatu destylacyjnego dokładnie odmierzone 25 ml kwasu siarkowego ((3.5) lub (3.6)), zależnie od przewidywanej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (3.7).

Podłączyć kolbę mineralizacyjną do chłodnicy aparatu do destylacji i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w kolbie odbieralnika na głębokość co najmniej 1 cm (w przypadku analizy produktów o niskiej zawartości azotu należy zmniejszyć objętość kwasu siarkowego (3.6) dodawanego do kolby odbieralnika do 10 lub 15 ml i dopełnić wodą do objętości 25 ml). Ostrożnie wlać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.8) do kolby mineralizacyjnej, nie dopuszczając do strat amoniaku (do oznaczania można stosować prosty sprzęt laboratoryjny, urządzenia półautomatyczne lub całkowicie zautomatyzowane. Jeżeli zastosowane urządzenie wymaga przeniesienia roztworu po mineralizacji do kolby destylacyjnej, czynność ta powinna być wykonana bez jakichkolwiek strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu i natychmiast podłączyć kolbę do chłodnicy, pozwalając, aby ciecz spływała powoli po ściankach). Ogrzewać kolbę aż do całkowitego oddestylowania amoniaku.

5.3. Miareczkowanie

Odmiareczkować nadmiar kwasu siarkowego w kolbie odbieralnika roztworem wodorotlenku sodu ((3.9) lub (3.10)), w zależności od stężenia zastosowanego kwasu siarkowego, do uzyskania punktu końcowego.

5.4. Ślepa próba

Celem potwierdzenia, że zastosowane odczynniki nie zawierają azotu, należy przeprowadzić ślepą próbę (mineralizacja, destylacja i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (3.13) zamiast próbki.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość białka surowego w procentach wagowych obliczyć według poniższego wzoru:

(V_o - V₁) x c x 0,014 x 100 x 6,25

-----------------------------------,

                m

w którym:

V_o -  objętość (ml) NaOH (3.9 lub 3.10) zużytego do miareczkowania ślepej próby,

V₁ -  objętość (ml) NaOH (3.9 lub 3.10) zużytego do miareczkowania próbki,

c -   stężenie (mol/l) roztworu wodorotlenku sodu (3.9 lub 3.10),

m -   masa (g) próbki.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie powinna przekraczać:

-   0,2% wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższych niż 20%;

-   1,0% wartości względnej wyższego wyniku dla zawartości białka surowego od 20% do 40%;

-   0,4% wartości bezwzględnej dla zawartości białka surowego wyższych niż 40%.

7.2. Dokładność

Przeprowadzić analizę (mineralizacja, destylacja i miareczkowanie) od 1,5 do 2,0 g acetanilidu (3.12) w obecności 1 g sacharozy (3.13); 1 g acetanilidu odpowiada 14,80 ml kwasu siarkowego (3.5). Stopień odzysku powinien wynosić co najmniej 99%.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Do oznaczania można stosować prosty sprzęt laboratoryjny, urządzenia półautomatyczne lub całkowicie zautomatyzowane. Jeżeli zastosowane urządzenie wymaga przeniesienia roztworu po mineralizacji do kolby destylacyjnej, czynność ta powinna być wykonana bez jakichkolwiek strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu i natychmiast podłączyć kolbę do chłodnicy, pozwalając, aby ciecz spływała powoli po ściankach.

8.2. Jeżeli roztwór po mineralizacji przechodzi w postać stałą, należy przeprowadzić oznaczanie, stosując większe ilości kwasu siarkowego (3.4), niż podano wyżej.

8.3. W przypadku analizy produktów o niskiej zawartości azotu należy zmniejszyć objętość kwasu siarkowego (3.6) dodawanego do kolby odbieralnika do 10 lub 15 ml i dopełnić wodą do objętości 25 ml.

2.2. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI AZOTU ROZPUSZCZALNEGO PO TRAKTOWANIU PEPSYNĄ W ROZCIEŃCZONYM KWASIE CHLOROWODOROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości azotu rozpuszczalnego po traktowaniu pepsyną w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym w paszach.

Metoda ta nie rozróżnia azotu białkowego od niebiałkowego.

Wartości otrzymane tą metodą nie mają bezpośredniego związku ze strawnością in vivo.

Jeżeli od wyniku konieczne jest odjęcie zawartości azotu niebiałkowego, zaleca się oznaczyć go, stosując odpowiednią metodę.

2. ZASADA METODY

Inkubacja próbki w roztworze pepsyny w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym przez 48 h w temperaturze 40°C. Filtracja zawiesiny i oznaczenie zawartości azotu w filtracie lub w pozostałości na sączku metodą Kjeldahla podaną w (Rozdział 2,2.1). W drugim przypadku oznaczyć zawartość azotu w próbce, zgodnie z metodą podaną w (Rozdział 2, 2.1).

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Stosować wyłącznie odczynniki o znanej czystości analitycznej i destylowaną lub dejonizowaną wodę lub wodę o równoważnej czystości. Odczynniki (z wyjątkiem substancji wzorcowych) nie powinny zawierać związków azotu.

3.1. Rozcieńczony kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,075 mol/l

3.2. Pepsyna o aktywności 2,0 jednostek na mg, zgodnie z objaśnieniem (Rozdział 2, 2.2.1). Aktywność pepsyny określić metodą opisaną w (Rozdział 2, 2.2.1).

3.3. Roztwór pepsyny w kwasie chlorowodorowym, aktywność pepsyny około 400 jednostek na litr

Rozpuścić 0,2 g ± 0,001 g pepsyny (3.2) w 1l rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego (3.1). Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Jeśli aktywność pepsyny odbiega od 2,0 jednostek na mg, skorygować masę pepsyny tak, aby otrzymać roztwór o aktywności pepsyny 400 jednostek na litr.

3.4. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 7,5 mol/l (d = 1,125 g/ml)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Łaźnia wodna lub cieplarka nastawiona na temperaturę 40°C ± 1°C

4.2. Kolba Kjeldahla o odpowiedniej pojemności

4.3. Bibuła filtracyjna o dużej szybkości sączenia, kwasoodporna

4.4. Zestaw do destylacji i miareczkowania

5. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI DO BADAŃ

Jeśli zawartość tłuszczu w próbce do badań przekracza 10% (m/m), tłuszcz wyekstrahować metodą podaną w (Rozdział 2, 2.8) i zawartość wyekstrahowanego tłuszczu wziąć pod uwagę w obliczeniach (7).

6. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

6.1. Odważka analityczna

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 2 g próbki do badań.

6.2. Inkubacja

Próbkę analityczną umieścić w kolbie pomiarowej o pojemności 500 ml i dodać 450 ml roztworu pepsyny (3.3) uprzednio podgrzanego do temperatury 40°C. Zawartość wstrząsnąć, ażeby uniknąć zbrylenia. Sprawdzić, czy pH zawiesiny jest mniejsze niż 1,7. Kolbę umieścić w łaźni wodnej lub w cieplarce (4.1) nastawionej na temperaturę 40°C i pozostawić na 48 h. Wstrząsnąć po 8 h, 24 h i 32 h.

Po upływie 48 h dodać 15 ml rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego (3.1) i ostudzić do temperatury 20°C. Uzupełnić wodą do kreski, wstrząsnąć i przesączyć przez sączek bibułowy (4.3). Postępować według (6.3) lub (6.4).

6.3. Oznaczanie zawartości azotu w filtracie

6.3.1. Mineralizacja materii organicznej

Odmierzyć 250 ml filtratu (6.2) i umieścić w kolbie Kjeldahla (4.2). Dodać niezbędnych odczynników do mineralizacji podanych w metodzie Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1, (5.1.)). Zamieszać i doprowadzić do wrzenia.

Może być konieczne dodanie czynnika zapobiegającego pienieniu.

Kontynuować wrzenie aż do niemal całkowitego odparowania wody. Ostrożnie usunąć resztki wody, zmniejszając intensywność grzania. Od momentu, kiedy roztwór stanie się klarowny, kontynuować ogrzewanie jeszcze przez 1 h, następnie pozostawić do ostygnięcia.

6.3.2. Destylacja i miareczkowanie

Postępować według metody Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1, (5.2) i (5.3)).

6.3.3. Próba ślepa

Przeprowadzić próbę ślepą według tego samego postępowania, lecz bez odważki analitycznej. Postępować zgodnie z (7).

6.4. Oznaczanie zawartości azotu w osadzie i w próbce do badań

6.4.1. Mineralizacja materii organicznej w osadzie

Przemywać sączek i osad (6.2) ciepłą wodą do usunięcia kwasu. Sączek wraz z pozostałością przenieść do kolby Kjeldahla (4.2). Dodać odczynniki niezbędne do mineralizacji według metody Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1, (5.1)). Zamieszać i doprowadzić do wrzenia.

Może być wskazane dodanie czynnika zapobiegającego pienieniu.

Odparować wodę poprzez gotowanie początkowo intensywne, a następnie przy zmniejszonym grzaniu usunąć resztę wody.

Od momentu, kiedy roztwór stanie się klarowny, kontynuować ogrzewanie jeszcze przez 1 godzinę, następnie pozostawić do ostygnięcia.

6.4.2. Destylacja i miareczkowanie

Postępować według metody Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1, (5.2) i (5.3)).

6.4.3. Oznaczanie zawartości azotu w próbce do badań

Oznaczać zawartość azotu w uprzednio przygotowanej próbce do badań metodą Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1).

6.4.4. Próba ślepa

Przeprowadzić próbę ślepą według tego samego postępowania, lecz bez odważki analitycznej.

7. OBLICZANIE WYNIKÓW

7.1. Obliczenie zawartości rozpuszczalnego azotu otrzymanego według (6.3)

Jeżeli spełniony jest warunek, że objętości kwasu siarkowego użytego do pochłaniania amoniaku w oznaczaniu i w próbie ślepej są równe (Rozdział 2, 2.1), obliczyć zawartość azotu w badanej próbce według równania:

    2(V₀-V₁)x c x M

w₁ = ----------------,

          m

w którym:

w₁ -  jest zawartością rozpuszczalnego azotu w badanej próbce, otrzymaną według postępowania opisanego w (6.3), w g/kg;

c -   jest stężeniem roztworu wodorotlenku sodu (Rozdział 2, 2.1, (3.10)) użytym do miareczkowania, w mol/l;

m -   jest masą odważki analitycznej, w g;

M -   jest masą molową azotu (M = 14 g/mol), w g/mol;

V₀ -  jest objętością roztworu wodorotlenku sodu (Rozdział 2, 2.1, (3.10)) zużytą do próby ślepej, w ml;

V₁ -  jest objętością roztworu wodorotlenku sodu (Rozdział 2, 2.1, (3.10)) zużytą do oznaczania (6.3.2), w ml.

Wyniki przedstawić z dokładnością do 0,1 g/kg.

7.2. Obliczenie zawartości rozpuszczalnego azotu otrzymanego według (6.4)

Jeżeli spełniony jest warunek, że objętości kwasu siarkowego użytego do pochłaniania amoniaku w oznaczaniu i w próbie ślepej są równe (według metody Kjeldahla (Rozdział 2,2.1)), obliczyć zawartość azotu w próbce badanej według równania:

         2(V˘₀-V˘₁)x c x M

w₂ = w_N - ----------------,

                m˘

w którym:

w₂ -  jest zawartością azotu rozpuszczalnego w badanej próbce, otrzymaną według postępowania opisanego w (6.4), w g/kg;

c -   jest stężeniem roztworu wodorotlenku sodu (Rozdział 2, 2.1, (3.10)) użytym do miareczkowania, w mol/l;

m -   jest masą odważki analitycznej, w g;

M -   jest masą molową azotu (M = 14 g/mol), w g/mol;

V₀ -  jest objętością roztworu wodorotlenku sodu (Rozdział 2, 2.1, (3.10)) zużytego do próby ślepej, w ml;

V₁ -  jest objętością roztworu wodorotlenku sodu (Rozdział 2, 2.1, (3.10)) zużytego do oznaczania (6.4.2), w ml;

w_N -  jest zawartością azotu w badanej próbce oznaczoną według (6.4.3), w g/kg.

Wyniki przedstawić z dokładnością do 0,1 g/kg.

7.3. Obliczanie zawartości rozpuszczalnego białka surowego

Jeżeli jest wymagane, aby wynik przedstawić jako zawartość rozpuszczalnego białka surowego, zawartość azotu rozpuszczalnego pomnożyć przez współczynnik 6,25.

8. SPRAWDZENIE METODY

8.1. Powtarzalność

Bezwzględna różnica pomiędzy dwoma niezależnymi pojedynczymi wynikami oznaczeń przeprowadzonych tą samą metodą, podczas badania identycznego materiału, w tym samym laboratorium, przez tego samego laboranta i na tym samym wyposażeniu w krótkim przedziale czasu, nie może w więcej niż 5% przypadków przekraczać granicy powtarzalności r podanej w tabeli 1.

8.2. Odtwarzalność

Bezwzględna różnica pomiędzy dwoma pojedynczymi wynikami oznaczeń przeprowadzonych tą samą metodą, podczas badania identycznego materiału, w różnych laboratoriach, przez różnych wykonawców i przy zastosowaniu różnego wyposażenia, nie może w więcej niż 5% przypadków przekraczać granicy odtwarzalności R podanej w tabeli 1.

Tabela 1: Granica powtarzalności (r) i granica odtwarzalności (R)

 

Próbka	Średnia zawartość białka ogólnego rozpuszczalnego g/kg1)	r g/kg	R g/kg
Mączka z lucerny	136,6	7,2	26,5
Mączka kukurydziana glutenowa	141,5	8,9	28,9
Mączka kokosowa	149,5	7,4	31,6
Kiszonka z traw	192,9	7,9	36,3
Mączka kostna	512,0	8,9	63,1
Mączka z pierza	574,3	22,1	166,3
1) w odniesieniu do suchej masy

 

9. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań powinno zawierać:

-   wszystkie informacje potrzebne do pełnej identyfikacji próbki;

-   metodę pobierania próbki, jeśli jest znana;

-   opis zastosowanej metody badania;

-   otrzymany wynik oznaczania, wyrażony jako wartość rozpuszczalnego azotu albo rozpuszczalnego białka surowego, w tym drugim przypadku z zastosowaniem współczynnika przeliczeniowego (tj. 6,25);

-   końcowy otrzymany wynik w przypadku sprawdzania powtarzalności.

2.2.1. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI PEPSYNY

1. CEL I ZAKRES

Metoda oznaczania aktywności pepsyny używanej podczas oznaczania zawartości azotu rozpuszczalnego po traktowaniu pepsyną w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym.

2. OBJAŚNIENIA

Jednostka aktywności pepsyny - to taka ilość pepsyny, która w ściśle określonych warunkach w ciągu minuty uwalnia taką ilość grup hydroksylowych, które po zabarwieniu odczynnikiem Folin-Ciocalteu mają gęstość optyczną odpowiadającą 1 µmol tyrozyny potraktowanej w ten sam sposób.

3. ZASADA METODY

Potraktowanie hemoglobiny roztworem pepsyny w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym. Strącenie niezhydrolizowanej frakcji protein kwasem trichlorooctowym. Przesączenie, a następnie dodanie wodorotlenku sodu i odczynnika Folin-Ciocalteu. Pomiar absorbancji roztworu przy długości fali 750 nm i odczyt odpowiadającej ilości tyrozyny z krzywej kalibracyjnej.

4. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Stosować wyłącznie odczynniki o znanej czystości analitycznej i destylowaną lub dejonizowaną wodę lub wodę o równoważnej czystości.

4.1. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,2 mol/l

4.2. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,06 mol/l

4.3. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,025 mol/l

4.4. Roztwór kwasu trichlorooctowego, d(CCL₃CO₂H) = 50g/l

4.5. Roztwór wodorotlenku sodu, c(NaOH) = 0,5mol/l

4.6. Odczynnik Folin-Ciocalteu

Umieścić 100 g dihydratu wolframianu(VI) sodu (Na₂WO₄ x 2H₂O), 25 g dihydratu molibdenianu(VI) sodu (Na₂MoO₄ x 2H₂O) i 700 ml wody w dwulitrowej kolbie okrągłodennej ze szlifem. Dodać 50 ml kwasu ortofosforowego(V) [d(H₃PO₄) = 1,71 g/ml] i 100 ml stężonego kwasu chlorowodorowego [d(HCl) = 1,19 g/ml]. Kolbę podłączyć do chłodnicy zwrotnej, doprowadzić roztwór do wrzenia i delikatnie gotować przez 10 h. Pozostawić do ostygnięcia, odłączyć chłodnicę zwrotną, dodać 175 g dihydratu siarczanu(VI) litu (Li₂SO₄ x 2H₂O), 50 ml wody, 1 ml bromu. Aby usunąć nadmiar bromu, gotować przez 15 min.

Pozostawić do ostygnięcia, następnie roztwór zdekantować do kolby pomiarowej o pojemności 1l. Uzupełnić zawartość kolby wodą do kreski, zamieszać i przesączyć. Dopuszczalny jest każdy kolor roztworu z wyjątkiem zielonkawego.

Przed użyciem jedną objętość odczynnika rozcieńczyć dwoma objętościami wody.

4.7. Roztwór hemoglobiny

Odważyć taką ilość hemoglobinobiałkowego substratu według metody Ansona (około 2 g), która odpowiada 354 mg azotu, a następnie umieścić w kolbie o pojemności 200 ml, ze szlifem i oznakowaniem objętości 100 ml.

W razie potrzeby oznaczyć zawartość azotu w substracie, stosując półmikrometodę Kjeldahla. Teoretyczna zawartość azotu wynosi 17,7% (m/m).

Dodać kilka ml rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego (4.2), połączyć kolbę z pompą próżniową i wstrząsać zawartość aż do zupełnego rozpuszczenia hemoglobiny. Odłączyć pompę i ciągle wstrząsając, rozcieńczać kwasem chlorowodorowym (4.2) do uzyskania objętości 100 ml. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4.8. Wzorcowy roztwór tyrozyny, c(C₉H₁₁NO₃) = 0,2 mmol/l

W celu uzyskania podstawowego roztworu wzorcowego, w kolbie pomiarowej o pojemności 11 rozpuścić 181,2 mg tyrozyny w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym (4.1) i uzupełnić zawartość kwasem do kreski.

Następnie pobrać pipetą 20 ml podstawowego roztworu wzorcowego do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml.

Rozcieńczyć zawartość kwasem chlorowodorowym (4.1) i uzupełnić kwasem do kreski. Stężenie tyrozyny w roztworze wzorcowym wynosi 0,2 µmol/ml (= 0,2 mmol/l).

5. APARATURA I SPRZĘT

Stosować aparaturę laboratoryjną, a w szczególności podaną poniżej:

5.1. Łaźnia wodna, ustawiona na temperaturę 25°C ± 1°C

5.2. Spektrometr, ustawiony na pomiar przy długości fali 750 nm

5.3. Chronometr z odczytem co 1 s

5.4. Pehametr z dokładnością odczytu 0,1 jednostki pH

5.5. Szklana bagietka z jednej strony wyciągnięta

6. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

6.1. Przygotowanie roztworu

Rozpuścić 150 mg pepsyny (lub ilość niezbędną do otrzymania wartości absorbancji 0,35 ± 0,035) w 100 ml rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego (4.2). Odpipetować 2 ml roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml i uzupełnić do kreski rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym (4.3). pH roztworu powinno wynosić 1,6 ± 0,1. Kolbę zanurzyć w łaźni wodnej (5.1) ustawionej na temperaturę 25°C.

6.2. Hydroliza

Odpipetować 5,0 ml roztworu hemoglobiny (4.7) do probówki, podgrzać do temperatury 25°C ± 1°C w łaźni wodnej (5.1). Dodać 1 ml roztworu pepsyny otrzymanego według (6.1) i zamieszać bagietką (5.5) około 10 razy w obydwie strony. Probówkę umieścić w łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 25°C ± 1°C i trzymać przez 10 min ± 1 s, licząc od momentu dodania roztworu pepsyny. Temperaturę należy koniecznie utrzymywać na stałym poziomie. Dodać 10 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (4.4) uprzednio podgrzanego do temperatury 25°C ± 1°C, zamieszać i przesączyć przez suchy sączek.

6.3. Wywołanie barwy i pomiar absorbancji

Odpipetować 5,0 ml filtratu do kolby stożkowej pojemności 50 ml, dodać 10 ml roztworu wodorotlenku sodu (4.5) i wstrząsając dodać 3 ml rozcieńczonego odczynnika Folin-Ciocalteu (4.6). Po upływie od 5 min do 10 min zmierzyć absorbancję roztworu względem wody przy długości fali 750 nm, używając spektrometru (5.2) i kuwety o drodze światła 1 cm.

6.4. Próba ślepa

Dla każdego oznaczania przeprowadzić próbę ślepą w następujący sposób.

Odpipetować 5,0 ml roztworu hemoglobiny (4.7) do probówki. Podgrzać do temperatury 25°C ± 1°C w łaźni wodnej (5.1), dodać 10 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (4.4) uprzednio ogrzanego do temperatury 25°C ± 1°C, zamieszać i dodać 1 ml roztworu pepsyny otrzymanego według (6.1). Zamieszać szklaną bagietką i wstawić probówkę do łaźni wodnej (5.1) o temperaturze 25°C ± 1°C na 10 min ± 1 s. Zamieszać i przesączyć przez suchy sączek. Dalej postępować jak w (6.3).

6.5. Krzywa kalibracyjna

Do sześciu kolb stożkowych o pojemności 50 ml odmierzyć 0 ml; 1,0 ml; 2,0 ml; 3,0 ml; 4,0 ml i 5,0 ml wzorcowego roztworu tyrozyny (4.8), co kolejno odpowiada 0 µmol; 0,2 µmol; 0,4 µmol; 0,6 µmol; 0,8 µmol i 1,0 µmol tyrozyny. Do każdej kolby dodać odpowiednią ilość rozcieńczonego kwasu chlorowodorowego (4.1), tak aby całkowita objętość w kolbie wynosiła 5,0 ml. Do każdej kolby dodać po 10 ml roztworu wodorotlenku sodu (4.5) i ciągle wstrząsając po 3 ml odczynnika Folin-Ciocalteu (4.6). Zmierzyć absorbancję każdego roztworu według (6.3). Wykreślić krzywą w układzie zależności absorbancji od zawartości tyrozyny wyrażonej w µmolach.

7. OBLICZANIE WYNIKÓW

Z krzywej kalibracyjnej odczytać, w µmolach, ilość tyrozyny, która odpowiada absorbancji wybarwionego roztworu i skorygować o wynik próby ślepej. Obliczyć aktywność pepsyny przy temperaturze 25°C ± 1°C, wyrażoną w µmolach tyrozyny na mg i na min, stosując równanie:

    3,2n

a = --------,

    m x t

w którym:

a -  jest aktywnością pepsyny w temperaturze 25°C ± 1°C, w µmol na mg i na min;

m -  jest masą użytej pepsyny wg (6.1), w mg;

n -  jest ilością tyrozyny odczytaną z krzywej kalibracyjnej, w µmol;

t -  jest czasem reakcji (t = 10 min), w min.

Dwie jednostki aktywności pepsyny na mg otrzymane z użyciem tej metody odpowiadają 3,64 milijednostkom Ansona na mg (µmol tyrozyny na mg na min w temperaturze 35,5°C) lub 36.400 handlowym jednostkom na g (µmol tyrozyny na g w ciągu 10 min w temperaturze 35,5°C).

2.3. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania wilgotności pasz. Metody nie stosuje się do badania produktów mlecznych występujących jako pasze jednoskładnikowe, substancji mineralnych i mieszanin składających się głównie z substancji mineralnych oraz nasion i owoców roślin oleistych.

2. ZASADA METODY

Próbka jest suszona w warunkach dostosowanych do właściwości pasz. Obniżenie masy jest określane poprzez ważenie.

Konieczne jest przeprowadzenie wstępnego suszenia w przypadku, gdy pasze zawierają duże ilości wilgoci.

3. APARATURA I SPRZĘT

3.1. Rozdrabniacz wykonany z materiałów niepochłaniających wilgoci, łatwy do czyszczenia, pozwalający na szybkie rozdrobnienie materiału bez nadmiernego ogrzewania, ograniczający do minimum kontakt z powietrzem, spełniający wymagania wymienione w (4.1.1) i (4.1.2) (np. chłodzony wodą mikrorozdrabniacz młotkowy, składany stożkowy młynek, rozdrabniacze wolnoobrotowe lub wyposażone w koło zębate)

3.2. Waga analityczna, dokładność 0,5 mg

3.3. Suche pojemniki z nierdzewnego metalu lub szkła z nakrywkami umożliwiającymi hermetyczne zamknięcie, o powierzchni roboczej umożliwiającej równomierne rozsypanie badanej próbki w warstwie 0,3 g/cm²

3.4. Suszarka elektryczna z termostatem (± 1°C), dobrze wentylowana i pozwalająca na szybką regulację temperatury¹⁾

3.5. Termostatowana suszarka próżniowa zaopatrzona w pompę olejową oraz mechanizm umożliwiający nawiew gorącego powietrza lub wprowadzenie czynnika suszącego (np. tlenku wapnia)

3.6. Eksykator z płytką z grubego perforowanego metalu lub porcelany, zawierający efektywny czynnik suszący

4. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Czynności opisane w tej części powinny być wykonywane szybko po otworzeniu opakowania próbki. Analiza powinna być wykonana co najmniej w dwóch powtórzeniach.

4.1. Przygotowanie

4.1.1. Pasze inne niż wymienione w (4.1.2) i (4.1.3) pobrać w ilości co najmniej 50 g. Jeśli to konieczne, rozdrobnić lub podzielić w taki sposób, aby zapobiec jakimkolwiek zmianom w zawartości wilgoci (7).

4.1.2. Zboża i kasze

Pobrać co najmniej 50 g próbki. Rozdrobnić na cząstki, które przechodzą przez sito o boku oczka kwadratowego 0,5 mm co najmniej w 50% i pozostają w ilości nie większej niż 10% na sicie o boku oczka kwadratowego 1 mm.

4.1.3. Pasze ciekłe lub w postaci pasty, pasze z przewagą olejów lub tłuszczów

Pobrać 25 g próbki, zważyć z dokładnością do 10 mg, dodać odpowiednią ilość suchego piasku, odważonego z dokładnością do 10 mg, i zmieszać do uzyskania homogennego produktu.

4.2. Suszenie

4.2.1. Pasze inne niż wymienione w (4.2.2) i (4.2.3)

Zważyć naczyńko (3.3) z przykrywką z dokładnością do 0,5 mg. Odważyć do naczyńka, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczyńko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 103°C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, należy umieścić naczyńko w suszarce tak szybko jak to możliwe. Suszyć przez 4 godziny od czasu, gdy suszarka osiągnie ponownie temperaturę 103°C. Nałożyć przykrywkę na naczyńko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Pasze z przeważającym udziałem oleju lub tłuszczu suszyć ponownie w suszarce przez 30 minut w temperaturze 130°C. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie powinna przekraczać 0,1% wilgotności.

4.2.2. Zboża, mąki, kasze i mączki

Zważyć naczyńko (3.3) z przykrywką z dokładnością do 0,5 mg. Odważyć do naczyńka, z dokładnością do 1 mg, około 5 g rozdrobnionej próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczyńko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 130°C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczyńko w suszarce tak szybko jak to możliwe. Suszyć przez dwie godziny, licząc od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 130°C. Nałożyć przykrywkę na naczyńko, wyjąć je z suszarki, pozostawić w eksykatorze (3.6) na 30 do 45 minut celem schłodzenia i zważyć z dokładnością do 1 mg.

4.2.3. Mieszanki paszowe zawierające ponad 4% sacharozy lub laktozy; surowce paszowe takie jak, chleb świętojański, hydrolizowane produkty zbożowe, słód jęczmienny, susz buraczany, hydrolizaty rybne i cukrowe, mieszanki z ponad 25% udziałem soli mineralnych zawierających wodę krystalizacyjną.

Zważyć naczyńko (3.3) z dokładnością do 0,5 mg. Odważyć do naczyńka, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczyńko bez przykrywki do suszarki próżniowej (3.5) podgrzanej do temperatury 80 do 85°C. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczyńko w suszarce tak szybko jak to możliwe. Zmniejszyć ciśnienie do 100 Torr i pozostawić na cztery godziny przy tym ciśnieniu, osuszając powietrze przy użyciu czynnika suszącego (około 300 g na 20 próbek). Po uzyskaniu żądanego ciśnienia odłączyć pompę próżniową. Czas suszenia należy liczyć od chwili, gdy suszarka osiągnie ponownie temperaturę 80 do 85°C. Ostrożnie zrównać ciśnienie w suszarce z ciśnieniem atmosferycznym. Otworzyć suszarkę, szybko nałożyć przykrywkę na naczyńko i usunąć je z suszarki. Pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (3.6) przez 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć ponownie w suszarce próżniowej przez 30 minut w temperaturze 80 do 85°C i zważyć powtórnie. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie powinna przekraczać 0,1% wilgotności.

4.3. Suszenie wstępne

4.3.1. Pasze inne niż wymienione w (4.3.2)

Pasze o wysokiej wilgotności, trudne do rozdrabniania, należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób:

Odważyć 50 g nierozdrobnionej próbki z dokładnością do 10 mg (pasze sprasowane lub zbrylone mogą być z konieczności wstępnie rozdrobnione) do odpowiedniego naczynia (np. na płytkę aluminiową o wymiarach 20 cm x 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce w temperaturze 60 do 70°C, aż zawartość wilgoci obniży się do 8 - 12%. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić na powietrzu do schłodzenia i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując, jak pokazano w (4.1.1), i suszyć według opisu w (4.2.1) lub (4.2.3) w zależności od rodzaju paszy.

4.3.2. Zboża

Ziarno zbóż o wilgotności wyższej niż 17% należy poddać wstępnemu suszeniu, jak następuje:

Odważyć 50 g nierozdrobnionego ziarna, z dokładnością do 10 mg, do odpowiedniego naczynia (np. na płytkę aluminiową o wymiarach 20 cm x 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce przez 5 do 7 minut w temperaturze 130°C.

Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić przez dwie godziny na powietrzu celem schłodzenia i zważyć z dokładnością do 10 mg.

Szybko rozdrobnić, postępując, jak pokazano w (4.1.2), i suszyć według opisu w (4.2.2).

5. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość wilgoci, w procentach wagowych, obliczyć przy wykorzystaniu poniższych wzorów.

5.1. Suszenie bez wstępnego podsuszania

(E - m) x 100/E,

gdzie:

E -   początkowa masa badanej próbki, w g,

m -   masa badanej próbki po wysuszeniu, w g.

5.2. Suszenie z podsuszaniem

[(M’ - m) M / M’ + E - M] 100 / E = 100 (1 - Mm / EM’),

gdzie:

E -   początkowa masa badanej próbki, w g,

M -   masa badanej próbki po wstępnym podsuszaniu, w g,

M’ -  masa badanej próbki po rozdrobnieniu, w g,

m -   masa badanej próbki po wysuszeniu, w g.

6. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie powinna przekraczać 0,2% wilgoci.

7. OBJAŚNIENIA

Gdy rozdrabnianie próbki okazuje się konieczne i jeżeli ten proces wpływa na zawartość wilgoci w produkcie, wyniki analizy komponentów paszowych powinny być skorygowane o zawartość wilgoci w początkowym stanie.

2.4. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI OLEJÓW I TŁUSZCZÓW

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości wody i substancji lotnych w tłuszczach i olejach pochodzenia zwierzęcego oraz roślinnego.

2. ZASADA METODY

Próbka jest suszona do stałej masy w temperaturze 103°C. Ubytek masy jest określany metodą wagową.

3. APARATURA I SPRZĘT

3.1. Naczynie z płaskim dnem wykonane z materiału nierdzewnego o średnicy 8 do 9 cm i wysokości 3 cm

3.2. Termometr rtęciowy z wzmocnionym zbiornikiem i nadmiarową rurką w górnym końcu, z podziałką od około 80°C do przynajmniej 110°C i o długości co najmniej 10 cm

3.3. Łaźnia piaskowa lub elektryczna płyta grzewcza

3.4. Eksykator zawierający efektywny środek suszący

3.5. Waga analityczna

4. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 20 g homogennej próbki do suchego, zważonego naczynia (3.1) zawierającego termometr (3.2). Ogrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzewczej (3.3), ciągle mieszając termometrem, tak aby uzyskać wzrost temperatury do 90°C w czasie około 7 minut.

Zmniejszyć ogrzewanie, obserwując częstotliwość odrywania się pęcherzyków powietrza od dna naczynia. Temperatura nie może przekroczyć 105°C. Kontynuować mieszanie, pocierając dno naczynia do czasu, aż przestaną się tworzyć pęcherzyki.

Aby być pewnym całkowitego odparowania wilgoci, ogrzewać próbkę kilka razy do temperatury 103°C ± 2°C, schładzając do 93°C pomiędzy kolejnymi ogrzewaniami. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej w eksykatorze (3.4) i zważyć. Powtarzać ogrzewanie, dopóki ubytek masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie większy od 2 mg.

Wzrost masy próbki po powtórnym ogrzewaniu wskazuje na utlenienie się tłuszczu. W takim przypadku do obliczania wyniku należy wziąć ostatnią masę próbki sprzed jej wzrostu.

5. OBLICZANIE WYNIKÓW

Wilgotność, w procentach wagowych, obliczyć według poniższego wzoru:

(M₁ - M₂) x 100/M₀,

w którym:

M₀ -  masa badanej próbki, w g;

M₁ -  masa naczynia z zawartością przed ogrzewaniem, w g;

M₂ -  masa naczynia z zawartością po ogrzewaniu, w g.

Wyniki oznaczania niższe od 0,05% należy zapisać jako "niższe od 0,05%".

6. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność:

Różnica wilgotności pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać 0,05 % wartości bezwzględnej.

2.5. OZNACZANIE POPIOŁU SUROWEGO

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości popiołu surowego w paszach.

2. ZASADA METODY

Spopielanie próbki w temperaturze 550°C i ważenie uzyskanego popiołu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Azotan amonu, roztwór 20% (m/V)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Płyta grzejna

4.2. Elektryczny piec do spalań z termostatem

4.3. Tygle do spalań platynowe lub ze stopu platyny i złota (10% Pt, 90% Au), prostokątne (60 x 40 x 25 mm) lub okrągłe (średnica 60 - 70 mm; wysokość 20 do 25 mm).

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki (2,5 g w przypadku substancji pęczniejących) i umieścić w tyglu do spalań wyprażonym i o stałej masie. Tygiel postawić na płycie grzewczej i ogrzewać stopniowo aż do zwęglenia. Następnie wstawić go do pieca ustawionego na temperaturę 550°C ± 5°C. Utrzymywać w tej temperaturze aż do uzyskania popiołu o barwie białej, jasnoszarej lub jasnoczerwonej, świadczącej o nieobecności cząsteczek węglowych. Umieścić tygiel w eksykatorze, pozostawić do ochłodzenia i zważyć.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość popiołu surowego X (%) obliczyć w procentach według wzoru:

        (a - b) * 100

X (%) = ---------------,

             m

w którym:

a -  masa tygla z próbką po spaleniu, w g,

b -  masa tygla, w g,

m -  masa próbki, w g.

Różnica zawartości popiołu surowego pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać 5% wartości względnej.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Substancje, które trudno się spopielają, należy spopielać wstępnie przez 3 godziny. Następnie po ochłodzeniu i dodaniu kilku kropli 20% roztworu azotanu amonu (dodawać ostrożnie, tak aby nie spowodować strat popiołu i tworzenia się zbryleń). Po wysuszeniu kontynuować zwęglanie w piecu. Powtarzać czynność aż do całkowitego spopielenia.

7.2. W przypadku gdy badane produkty trudno poddają się postępowaniu opisanemu w (7.1), należy przyjąć poniższą procedurę.

Po spopielaniu przez 3 godziny umieścić popiół w ciepłej wodzie i przesączyć przez mały, bezpopiołowy sączek. Spalić sączek z zawartością w tyglu. Filtrat umieścić w schłodzonym tyglu, odparować do sucha, spopielić i zważyć.

7.3. W przypadku olejów i tłuszczów odważka powinna wynosić 25 g. Zwęglać w tyglu odpowiedniej wielkości, przenosząc płomień na substancję skrawkiem bezpopiołowej bibuły filtracyjnej. Po spaleniu pozostałość zwilżyć małą ilością wody. Wysuszyć i spopielać, jak opisano w (5).

2.6. OZNACZANIE POPIOŁU NIEROZPUSZCZALNEGO W KWASIE CHLOROWODOROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania substancji mineralnych nierozpuszczalnych w kwasie chlorowodorowym w paszach. W zależności od rodzaju tych substancji stosujemy dwie metody:

1.1. Metoda A: mająca zastosowanie do pasz organicznych i do większości materiałów paszowych.

1.2. Metoda B: mająca zastosowanie do pasz mineralnych, ich mieszanin oraz do materiałów paszowych zawierających substancje nierozpuszczalne w kwasie chlorowodorowym w ilości powyżej 1%, co sprawdza się, stosując wcześniej metodę A.

2. ZASADA METODY

2.1. Metoda A: próbka jest spopielana, popiół gotowany w kwasie chlorowodorowym, a nierozpuszczalna pozostałość jest sączona i ważona.

2.2. Metoda B: próbkę zadaje się kwasem chlorowodorowym, roztwór sączy, pozostałość spopiela i otrzymany popiół traktuje jak w metodzie A.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, roztwór 3 mol/l (3 N)

3.2. Kwas trichlorooctowy, 20% roztwór (m/V)

3.3. Kwas trichlorooctowy, 1% roztwór (m/V)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Płyta grzejna

4.2. Elektryczny piec do spalań z termostatem

4.3. Tygle do spalań platynowe lub ze stopu platyny i złota (10% Pt, 90% Au) prostokątne (60 x 40 x 25 mm) lub okrągłe (średnica 60 - 70 mm; wysokość 20 do 25 mm)

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Metoda A

Spopielić próbkę metodą opisaną przy oznaczaniu popiołu surowego. Popiół uzyskany z tej analizy może być także wykorzystany.

Przenieść popiół do zlewki o pojemności 250 do 400 ml przy pomocy 75 ml kwasu chlorowodorowego 3 mol/l (3.1). Powoli doprowadzić do wrzenia i gotować ostrożnie przez 15 minut. Przesączyć gorący roztwór przez bibułę bezpopiołową i przemywać pozostałość gorącą wodą. Osad przemywać do zaniku kwaśnego odczynu. Wysuszyć sączek z osadem i spopielić w uprzednio zważonym tyglu w temperaturze nie niższej od 550°C i nie wyższej od 700°C. Ostudzić w eksykatorze i zważyć.

5.2. Metoda B

Odważyć 5 g próbki, z dokładnością do 1 mg, i umieścić w zlewce o pojemności od 250 do 400 ml. Dodać kolejno 25 ml wody i 25 ml kwasu chlorowodorowego 3 mol/l (3.1), wymieszać i odczekać, aż roztwór przestanie się burzyć. Dodać kolejne 50 ml kwasu chlorowodorowego 3 mol/l (3.1). Odczekać do ulotnienia się gazu, umieścić zlewkę we wrzącej łaźni wodnej i trzymać ją tam przez 30 minut lub w razie potrzeby dłużej w przypadku całkowitej hydrolizy skrobi obecnej w próbce.

Gorący roztwór przesączyć przez sączek bezpopiołowy i przemyć 50 ml gorącej wody (gdy sączenie przebiega trudno, zaleca się w toku analizy zastąpienie 50 ml kwasu chlorowodorowego 3 mol/l (3.1) 50 ml kwasu trichlorooctowego (3.2) i przemycie sączka ciepłym roztworem kwasu trichlorooctowego (3.3)). Sączek z osadem umieścić w tyglu od spalań, wysuszyć i spopielać w temperaturze nie niższej od 550°C i nie wyższej od 700°C. Umieścić popiół w 250 do 400 ml zlewce za pomocą 75 ml kwasu chlorowodorowego 3 mol/l (3.1). Powoli doprowadzić do wrzenia i gotować ostrożnie przez 15 minut.

Przesączyć gorący roztwór przez bibułę bezpopiołową i przemywać pozostałość gorącą wodą. Osad przemywać do zaniku kwaśnego odczynu. Wysuszyć sączek z osadem i spopielić w uprzednio zważonym tyglu w temperaturze nie niższej od 550°C i nie wyższej od 700°C. Ostudzić w eksykatorze i zważyć.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość popiołu nierozpuszczalnego w kwasie chlorowodorowym X (%) obliczyć w procentach według wzoru:

      (a - b) * 100

X(%) = --------------,

            m

w którym:

a -  masa tygla z pozostałością po wyprażeniu osadu, w g,

b -  masa tygla, w g,

m -  masa próbki, w g.

Różnica zawartości popiołu nierozpuszczalnego w kwasie chlorowodorowym pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać 10% wartości względnej.

7. OBJAŚNIENIA

Gdy sączenie przebiega trudno, zaleca się w toku analizy zastąpienie 50 ml kwasu chlorowodorowego 3 mol/l (3.1) 50 ml kwasu trichlorooctowego (3.2) i przemycie sączka ciepłym roztworem kwasu trichlorooctowego (3.3).

2.7. OZNACZANIE WŁÓKNA SUROWEGO

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania w paszach nietłuszczowych substancji organicznych, które nie rozpuszczają się ani w środowisku kwaśnym, ani zasadowym i które zwyczajowo określa się mianem włókna surowego.

2. ZASADA METODY

Próbkę, w razie konieczności odtłuszczoną, gotuje się w roztworach kwasu siarkowego i wodorotlenku potasu o odpowiednim stężeniu. Osad oddziela się na filtrze ze szklanym spiekiem, przemywa, suszy i spopiela w temperaturze od 475 do 500°C. Ubytek masy po spopielaniu odpowiada zawartości włókna surowego w badanej próbce.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas siarkowy, c = 0,13 mol/l

3.2. Odczynnik przeciwpieniący (np. n-oktanol)

3.3. Materiał wspomagający sączenie (Celit 545 lub podobny), wyprażony w temperaturze 500°C przez cztery godziny (8.6).

3.4. Aceton

3.5. Eter naftowy, temperatura wrzenia 40 do 60°C

3.6. Kwas chlorowodorowy, c = 0,5 mol/l

3.7. Roztwór wodorotlenku potasu, c = 0,23 mol/l

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Zestaw grzewczy do gotowania w roztworach kwasu siarkowego lub wodorotlenku potasu, wyposażony w podstawkę mocującą tygiel filtracyjny (4.2), rurkę odprowadzającą ciecz z kranem i pompę próżniową, jeśli to możliwe na sprężone powietrze. Przed użyciem przemywać zestaw wrzącą wodą przez 5 minut.

4.2. Szklany tygiel filtracyjny ze spiekiem o porach 40 - 90 mm. Przed pierwszym użyciem ogrzewać przez 5 minut w temperaturze 500°C i schłodzić (8.6).

4.3. Cylinder o pojemności przynajmniej 270 ml z chłodnicą zwrotną, przystosowany do gotowania

4.4. Suszarka z termostatem

4.5. Piec muflowy z termostatem

4.6. Zestaw do ekstrakcji składający się z podstawki mocującej tygiel filtracyjny (4.2) i z odłączanej rurki z kranem z wylewką, podłączanej do pompy próżniowej

4.7. Pierścienie łączące do połączenia zestawu grzewczego (4.1), tygla filtracyjnego (4.2), cylindra (4.3) i zestawu ekstrakcyjnego do ekstrakcji na zimno (4.6) z tyglem

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1 g przygotowanej próbki do tygla (4.2) ((8.1), (8.2), (8.3)) i dodać 1 g materiału wspomagającego sączenie (3.3). Zestaw grzewczy (4.1) połączyć z tyglem filtracyjnym (4.2), a następnie przyłączyć cylinder do tygla. Wlać 150 ml wrzącego kwasu siarkowego (3.1) do cylindra połączonego z tyglem i, w razie potrzeby, dodać kilka kropli odczynnika przeciwpieniącego (3.2). Doprowadzić ciecz do wrzenia w przeciągu 5 ± 2 minut i energicznie gotować dokładnie przez 30 minut. Otworzyć kran w rurce odprowadzającej (4.1), przesączyć, pod zmniejszonym ciśnieniem, kwas siarkowy przez tygiel filtracyjny i przemyć pozostałość trzykrotnie 30 ml porcjami wrzącej wody, upewniając się, że pozostałość przesączono do sucha po każdym przemyciu.

Zamknąć kurek i wlać 250 ml wrzącego roztworu wodorotlenku potasu (3.7) do cylindra połączonego z tyglem i dodać kilka kropli odczynnika przeciwpieniącego (3.2). Doprowadzić ciecz do wrzenia w przeciągu 5 ± 2 minut i gotować energicznie dokładnie przez 30 minut. Przesączyć i powtórzyć przemywanie jak po gotowaniu w kwasie siarkowym.

Po ostatnim przemyciu i wysuszeniu odłączyć tygiel z zawartością i zamocować go w zestawie do zimnej ekstrakcji (4.6).

Podłączyć pompę próżniową i przemywać pozostałość w tyglu trzema kolejnymi porcjami 25 ml acetonu (3.4), upewniając się, że po każdym przemyciu osad został odsączony do sucha. Wysuszyć tygiel do stałej masy w suszarce ustawionej na temperaturę 130°C. Po każdym suszeniu schłodzić w eksykatorze i niezwłocznie zważyć. Umieścić tygiel w piecu i spopielać do stałej masy w temperaturze 475 - 500°C przez co najmniej 30 minut. Przed ważeniem tygla, po każdym spopielaniu należy najpierw schłodzić tygiel w piecu, a następnie w eksykatorze.

Przeprowadzić test ślepej próby. Ubytek masy po spopielaniu nie może przekraczać 4 mg.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość włókna surowego w próbce obliczyć w procentach według wzoru:

(b - c) x 100

-------------

     a

gdzie:

a -  masa próbki, w g;

b -  ubytek masy po spopieleniu, w g;

c -  ubytek masy ślepej próbki po spopieleniu, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy dwoma równoległymi oznaczeniami tej samej próbki nie może przekraczać:

-   0,3% wartości bezwzględnej przy zawartościach włókna surowego niższych niż 10%,

-   3% wartości względnej w odniesieniu do wyższego wyniku, przy zawartościach włókna surowego równych lub wyższych od 10%.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Pasze zawierające ponad 10% tłuszczu surowego należy przed oznaczaniem odtłuścić eterem naftowym (3.5). W tym celu połączyć tygiel filtracyjny (4.2) z zawartością do zestawu ekstrakcyjnego do zimnej ekstrakcji (4.6) i za pomocą pompy próżniowej przemyć zawartość trzykrotnie 30 ml porcjami eteru naftowego, upewniając się, że pozostałość jest sucha. Połączyć tygiel z zestawem grzewczym (4.1) i kontynuować, jak opisano w (5).

8.2. Pasze zawierające tłuszcze, które nie ekstrahują się bezpośrednio eterem naftowym (3.5), należy odtłuścić, jak podano w (8.1), i ponownie odtłuścić po gotowaniu w kwasie.

Po gotowaniu w kwasie i przemyciu podłączyć tygiel z zawartością do zestawu do zimnej ekstrakcji (4.6) i przemyć trzykrotnie 30 ml acetonu, a następnie trzykrotnie 30 ml porcjami eteru naftowego. Odsączyć pod próżnią do sucha i kontynuować sposób postępowania, jak to opisano w (5), rozpoczynając od dodania wodorotlenku potasu.

8.3. W przypadku gdy pasze zawierają ponad 5% węglanów, w przeliczeniu na węglan wapnia, podłączyć tygiel (4.2) z odważoną próbką do zestawu grzewczego (4.1). Przemyć próbkę trzykrotnie 30 ml porcjami kwasu chlorowodorowego (3.6). Po dodaniu każdej porcji kwasu pozostawić próbkę na około minutę przed sączeniem. Przemyć 30 ml wody i kontynuować sposób postępowania, jak opisano w (5).

8.4. Jeżeli kilka tygli może być podłączonych do jednego zestawu grzewczego, nie należy wykonywać dwóch pojedynczych oznaczeń próbki w tej samej serii.

8.5. Jeśli po gotowaniu w kwasie i zasadzie roztwory trudno się sączą, przepuścić sprężone powietrze przez rurkę dołączaną do zestawu grzewczego i następnie kontynuować sączenie.

8.6. Temperatura spopielania nie powinna przekraczać 500°C ze względu na wytrzymałość szklanego tygla. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nagłego szoku termicznego podczas ogrzewania i schładzania.

2.8. OZNACZANIE SUROWEGO OLEJU I TŁUSZCZU

1. CEL I ZAKRES

Opisano metodę oznaczania surowych olejów i tłuszczów w paszach. Metody nie stosuje się do analizy nasion i owoców roślin oleistych.

Zastosowanie dwóch sposobów postępowania opisanych poniżej zależy od natury i składu paszy oraz celu prowadzenia oznaczeń.

1.1. Postępowanie A - bezpośrednio ekstrahowane oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do surowców paszowych pochodzenia roślinnego, z wyjątkiem tych, które zostały objęte zakresem postępowania B.

1.2. Postępowanie B - całkowite surowe oleje i tłuszcze

Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego i wszystkich mieszanek paszowych. Jest stosowane do tych wszystkich materiałów, z których oleje i tłuszcze nie mogą być w całości wyekstrahowane bez uprzedniej hydrolizy (np. gluten, drożdże, białka ziemniaczane i produkty poddane przetwarzaniu, np. poprzez ekstruzję, płatkowanie i ogrzewanie).

1.3. Interpretacja wyników

We wszystkich przypadkach kiedy wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B jest wyższy od otrzymanego przy zastosowaniu postępowania A, należy traktować wynik otrzymany według postępowania B jako rzeczywisty.

2. ZASADA METODY

2.1. Postępowanie A

Próbka jest poddawana ekstrakcji eterem naftowym. Roztwór jest odparowywany, a pozostałość jest suszona i ważona.

2.2. Postępowanie B

Próbka jest ogrzewana z kwasem chlorowodorowym. Mieszanina jest oziębiana i sączona. Pozostałość jest przemywana i suszona, a następnie poddawana oznaczaniu zgodnie z postępowaniem A.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Eter naftowy o zakresie temperatur wrzenia od 40 do 60°C. Wartość bromowa powinna być mniejsza niż 1, a pozostałość po odparowaniu mniejsza od 2 mg/100 ml.

3.2. Siarczan sodu bezwodny

3.3. Kwas chlorowodorowy, c = 3 mol HCl/l

3.4. Materiał wspomagający sączenie, np. Kieselguhr, Hyflo-supercel

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Aparat do ekstrakcji. Jeżeli jest wyposażony w syfon (aparat Soxhleta), szybkość skraplania powinna być taka, aby liczba powrotów (przelewania skroplin) wynosiła 10 cykli na godzinę. Jeżeli aparat nie ma syfonu, to objętość skroplin powinna wynosić około 10 ml na minutę.

4.2. Gilzy do ekstrakcji, niezawierające substancji rozpuszczalnych w eterze naftowym i o porowatości odpowiadającej wymaganiom zawartym w (4.1).

4.3. Suszarka próżniowa z możliwością ustawienia temperatury suszenia 75°C ± 3°C lub suszarka nawiewna z możliwością ustawienia temperatury 100°C ± 3°C.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Postępowanie A

Uwzględnić (7)

Odważyć 5 g próbki, z dokładnością do 1 mg, przenieść do gilzy ekstrakcyjnej (4.2) i przykryć tamponem z beztłuszczowej waty bawełnianej. Umieścić gilzę w aparacie do ekstrakcji (4.1) i ekstrahować przez 6 godzin eterem naftowym (3.1). Zebrać ekstrakt eterowy do suchej, zważonej kolby zawierającej kawałki pumeksu²⁾.

Oddestylować rozpuszczalnik. Suszyć pozostałość, umieszczając kolbę w suszarce (4.3) na okres półtorej godziny.

Ochłodzić w eksykatorze i zważyć. Suszyć ponownie przez 30 minut do stałej masy (straty masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie mogą przekraczać 1 mg).

5.2. Postępowanie B

Odważyć 2,5 g próbki, z dokładnością do 1 mg (dla produktów o niskiej zawartości olejów i tłuszczów próbkę analityczną można zwiększyć do 5 g), umieścić w zlewce o pojemności 400 ml lub w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml i dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) oraz kawałki pumeksu. Przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym, a kolbę chłodnicą zwrotną. Doprowadzić mieszaninę do spokojnego wrzenia w małym płomieniu palnika lub na płytce grzejnej i utrzymywać wrzenie przez jedną godzinę. Nie dopuszczać do osadzania się produktu na ścianach naczynia.

Ochłodzić i dodać materiału filtracyjnego (3.4) w ilości zapobiegającej jakimkolwiek stratom oleju i tłuszczu podczas sączenia. Przesączyć przez zwilżony, beztłuszczowy podwójny sączek papierowy. Przemywać pozostałość zimną wodą do uzyskania obojętnego przesączu. Sprawdzić, czy przesącz nie zawiera śladów olejów lub tłuszczów. Ich obecność wskazuje na konieczność przeprowadzenia przed hydrolizą ekstrakcji zgodnie z postępowaniem A.

Umieścić na szkiełku zegarkowym podwójną bibułę filtracyjną z pozostałością i suszyć przez półtorej godziny w suszarce nawiewnej (4.3) w temperaturze 100°C ± 3°C.

Umieścić podwójny sączek z suchą pozostałością w gilzie ekstrakcyjnej (4.2) i przykryć beztłuszczowym zwitkiem waty.

Umieścić gilzę w aparacie do ekstrakcji (4.1) i postępować zgodnie z opisem podanym w (5.1).

Wyrazić masę pozostałości jako procent wagowy próbki.

6. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce przez tego samego analityka nie powinny przekroczyć:

-   0,2% wartości bezwzględnej dla zawartości oleju i tłuszczu poniżej 5%,

-   4,0% wartości względnej w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości od 5 do 10%,

-   0,4% wartości bezwzględnej dla zawartości powyżej 10%.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Dla produktów o wysokiej zawartości olejów i tłuszczów, które są trudne do rozdrobnienia lub osiągnięcia homogenności próbki badanej, postępować, jak podano poniżej.

Odważyć 20 g próbki, z dokładnością do 1 mg, i wymieszać z 10 g lub więcej bezwodnego siarczanu sodu (3.2).

Ekstrahować eterem naftowym (3.1), jak podano w (5.1). Uzupełnić eterem (3.1) otrzymany ekstrakt do objętości 500 ml i zamieszać. Pobrać 50 ml roztworu i przenieść do małej, suchej i zważonej kolby zawierającej kawałki pumeksu²⁾.

Odparować rozpuszczalnik, suszyć i postępować dalej, jak wskazano w (5.1).

Usunąć rozpuszczalnik z pozostałości po ekstrakcji w gilzie, rozdrobnić pozostałość na cząstki 1 mm, ponownie umieścić w gilzie (nie dodawać siarczanu sodu). Umieścić gilzę w aparacie do ekstrakcji (4.1) i postępować, jak podano w (5.1).

Przeliczyć zawartość oleju i tłuszczu, wyrażając w procentach wagowych, stosując następujący wzór:

(10 a + b) x 5,

gdzie:

a -  masa, w g, pozostałości po pierwszej ekstrakcji (część ekstraktu),

b -  masa, w g, pozostałości po drugiej ekstrakcji.

7.2. Dla produktów o niskiej zawartości olejów i tłuszczów próbkę analityczną można zwiększyć do 5 g.

7.3. W przypadku karmy dla zwierząt domowych o wysokiej zawartości wody może być konieczne dodanie przed hydrolizą i ekstrakcją bezwodnego siarczanu sodu przed postępowaniem B.

7.4. W (5.2) do przemywania pozostałości po przesączeniu może być bardziej efektywne użycie wody gorącej zamiast zimnej.

7.5. W przypadku niektórych pasz czas suszenia 1,5 godziny może być przedłużony. Należy jednak unikać nadmiernego suszenia, gdyż może to prowadzić do zaniżania wyników. Można również stosować kuchenki mikrofalowe.

7.6. Jeżeli zawartość surowego oleju lub tłuszczu jest większa niż 15%, zaleca się zastosowanie wstępnej ekstrakcji według postępowania A przed hydrolizą i powtórną ekstrakcją według postępowania B. W niektórych przypadkach zależy to od natury paszy i natury oleju lub tłuszczu w paszy.

2.9. OZNACZANIE SKROBI METODĄ POLARYMETRYCZNĄ

1. CEL I ZAKRES

Opisano polarymetryczną metodę oznaczania zawartości skrobi i wysokocząsteczkowych produktów jej rozkładu w paszach.

2. ZASADA METODY

Metoda składa się z dwóch oznaczeń. W pierwszym próbka jest traktowana gorącym rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Po sklarowaniu i przesączeniu mierzy się polarymetrycznie skręcalność optyczną światła spolaryzowanego. W drugim próbka jest ekstrahowana 40% etanolem. Po zakwaszeniu filtratu kwasem chlorowodorowym, sklarowaniu i przesączeniu mierzona jest ponownie płaszczyzna skręcania światła spolaryzowanego jak w pierwszym oznaczeniu. Różnica pomiędzy dwoma pomiarami, pomnożona przez znany współczynnik, daje zawartość skrobi w próbce.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, 25% (w/w) d = 1,126 g/ml

3.2. Kwas chlorowodorowy, o stężeniu 1,128% (w/v)

Stężenie należy sprawdzić, miareczkując kwas roztworem wodorotlenku sodowego 0,1 mol/l w obecności czerwieni metylowej 0,1% (w/v) w 94% (V/V) etanolu. 10 ml = 30,94 ml NaOH o stężeniu 0,1 mol/l.

3.3. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn(CH₃COOH)₂ x 2H₂O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Dopełnić wodą do 100 ml.

3.4. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g heksacyjanożelazianu(II) potasu [K₄Fe(CN)₆] x 3H₂O. Uzupełnić do 100 ml wodą.

3.5. Etanol, 40% (V/V), d = 0,948 g/ml w temperaturze 20°C.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 250 ml, ze szlifem i chłodnicą zwrotną

4.2. Polarymetr lub sacharymetr

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, by przesiewała się przez sito o wymiarach oczka 0,5 mm.

5.2. Oznaczanie całkowitej skręcalności optycznej (P lub S) (jeśli próbka zawiera więcej niż 6% węglanów, w przeliczeniu na węglan wapniowy, należy je rozłożyć rozcieńczonym kwasem siarkowym przed określeniem skręcalności optycznej)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g rozdrobnionej próbki i umieścić kolbie miarowej o pojemności 100 ml.

Dodać 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), wstrząsnąć do równomiernego rozprowadzenia próbki i dodać następną porcję 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.2). Kolbę zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Aby zapobiec aglomeracji, przez pierwsze trzy minuty nieprzerwanie wstrząsać kolbą. Systematycznie uzupełniać wodę w łaźni, ale tak, by woda ciągle się gotowała, gdy jest w niej zanurzona kolba. Nie wyjmować kolby z wody w trakcie wstrząsania. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę z wody, dodać 30 ml zimnej wody i natychmiast schłodzić do temperatury 20°C.

Dodać 5 ml roztworu Carreza I (3.3) i wstrząsać przez 1 minutę. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.4) i ponownie wstrząsać przez 1 minutę. Uzupełnić wodą do kreski, wymieszać i przesączyć. W wypadku gdy przesącz nie jest idealnie klarowny (co zdarza się rzadko), powtórzyć oznaczanie z większą ilością roztworów Carreza I i II, np. pobierając po 10 ml. Zmierzyć skręcalność optyczną roztworu w 200 mm rurce za pomocą polarymetru lub sacharymetru.

5.3. Oznaczanie skręcalności optycznej (P’ lub S’) produktów rozpuszczonych w 40% etanolu

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, umieścić w 100 ml kolbie miarowej i dodać około 80 ml etanolu (3.5) (w przypadku produktów o wysokiej zawartości laktozy, takich jak sproszkowana serwatka lub mleko w proszku, po dodaniu 80 ml etanolu (3.5) postępować w następujący sposób: dołączyć do kolby chłodnicę zwrotną i zanurzyć kolbę w łaźni o temperaturze 50°C na 30 minut. Pozostawić do ochłodzenia i kontynuować analizę tak jak w (5.3). Pozostawić kolbę na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, wstrząsając w tym czasie sześciokrotnie kolbą tak, by próbka została dobrze wymieszana z etanolem. Uzupełnić etanolem (3.5) do kreski, wymieszać i przesączyć.

Pobrać pipetą 50 ml przesączu (= 2,5 g próbki) do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, dodać 2,1 ml kwasu chlorowodorowego (3.1.) i energicznie wstrząsnąć. Dołączyć do kolby Erlenmeyera chłodnicę zwrotną i zanurzyć we wrzącej łaźni wodnej. Dokładnie po 15 minutach wyjąć kolbę Erlenmeyera z łaźni, przenieść zawartość do kolby miarowej o pojemności 100 ml, spłukać kolbę Erlenmeyera niewielką ilością zimnej wody i schłodzić do temperatury 20°C. Sklarować roztworem Carreza I (3.3) i II (3.4), uzupełnić wodą do kreski, wymieszać, przesączyć i zmierzyć skręcalność optyczną, jak podano w (5.2).

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość skrobi (%) obliczyć w następujący sposób:

6.1. Pomiary przy użyciu polarymetru

Zawartość skrobi (%) = 2000 (P - P’) / [a]^20°_D

P -   całkowita skręcalność optyczna w stopniach kątowych,

P’ -  skręcalność optyczna w stopniach kątowych substancji rozpuszczonych w 40% (V/V) etanolu,

[a]^20°_D - skręcalność właściwa czystej skrobi. Wartości liczbowe przyjęte dla skręcalności właściwej są następujące:

+ 185,9°: skrobia ryżowa

+ 185,4°: skrobia ziemniaczana

+ 184,6°: skrobia kukurydziana

+ 182,7°: skrobia pszenna

+ 181,5°: skrobia jęczmienna

+ 181,3°: skrobia owsiana

+ 184,0°: inne typy skrobi i mieszaniny w mieszankach paszowych.

6.2. Pomiary przy użyciu sacharymetru

Zawartość skrobi (%) = 2000/[a]^20°_D x [(2N x 0,665) x (S - S’)/100] - [26,6 N x (S - S’)/[a]^20°_D]

S -   całkowita skręcalność optyczna w stopniach sacharymetru,

P' -  skręcalność optyczna w stopniach sacharymetru substancji rozpuszczonych w 40% (V/V) etanolu,

N -   masa (g) sacharozy w 100 ml wody powodująca skręcalność 100 stopni sacharymetru, mierzona przez 200 mm rurkę:

16,29 g dla sacharymetrów francuskich,

26,00 dla sacharymetrów niemieckich,

20,00 dla sacharymetrów pozostałych,

[a]^20°_D - skręcalność właściwa czystej skrobi.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać 0,4% wartości bezwzględnej dla zawartości poniżej 40% i 1,1% wartości względnej dla zawartości skrobi równej lub wyższej 40%.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Jeśli próbka zawiera więcej niż 6% węglanów, w przeliczeniu na węglan wapniowy, należy je rozłożyć rozcieńczonym kwasem siarkowym przed określeniem skręcalności optycznej.

8.2. W przypadku produktów o wysokiej zawartości laktozy, takich jak sproszkowana serwatka lub mleko w proszku, po dodaniu 80 ml etanolu (3.5) postępować w następujący sposób: dołączyć do kolby chłodnicę zwrotną i zanurzyć kolbę w łaźni o temperaturze 50°C na 30 minut. Pozostawić do ochłodzenia i kontynuować analizę tak jak w (5.3).

8.3. Następujące materiały paszowe, w przypadku gdy są obecne w znacznych ilościach w paszy, powodują interferencje podczas określania zawartości skrobi metodą polarymetryczną i mogą wpływać na otrzymywanie nieprawidłowych wyników:

-   cukier, produkty pochodne buraków cukrowych, takie jak miazga, melasa,

-   miazga cytrusowa,

-   siemię lniane, wytłoczyny z siemienia lnianego, siemię lniane ekstrahowane,

-   nasiona rzepaku, wytłoczyny rzepakowe, śruta rzepakowa, łuska rzepakowa,

-   nasiona słonecznika, ekstrahowane, częściowo odłuszczone,

-   wytłoczyny z kopry, pozostałość po ekstrakcji,

-   miazga ziemniaczana,

-   drożdże odwodnione,

-   produkty bogate w inulinę (chipsy i inne produkty z karczochów),

-   skwarki.

2.10. OZNACZANIE SKROBI METODĄ PANKREATYNOWĄ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości skrobi i produktów jej rozkładu o dużej masie cząsteczkowej w paszach zawierających susz buraczany, wysłodki buraczane, suszone główki i liście buraczane, pulpę ziemniaczaną, suszone drożdże, produkty bogate w inulinę (np. susz, mączka z topinamburu oraz produkty zawierające skwarki). Oznaczanie tą metodą może być wykonywane tylko wtedy, gdy wcześniej przeprowadzane obserwacje mikroskopowe wykażą znaczną zawartość skrobi w próbce.

2. ZASADA METODY

Cukry ekstrahowane są etanolem. Skrobia znajdująca się w pozostałości po ekstrakcji jest rozkładana do cukrów prostych pankreatyną. Utworzone cukry hydrolizuje się następnie kwasem chlorowodorowym i powstałą glukozę oznacza metodą Luff-Schoorla. Ilość oznaczonej glukozy pomnożona przez odpowiedni współczynnik daje zawartość skrobi w próbce.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Etanol 90% (V/V), obojętny wobec fenoloftaleiny

3.2. Pentan-1-ol (alkohol amylowy)

3.3. Toluen

3.4. Roztwór buforowy: rozpuścić w wodzie 9,078 g diwodorofosforanu(V) potasu KH₂PO₄ i 11,876 g wodorofosforanu(V) disodu Na₂HPO₄ x 2H₂O. Uzupełnić wodą do litra.

3.5. Roztwór chlorku sodowego 0,2 mol/l (0,2 N)

3.6. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku Zn(CH₃COO)₂ x 2H₂O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Uzupełnić wodą do 100 ml.

3.7. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g heksacyjanożelazianu(II) potasu K₄[Fe(CN)₆] x 3H₂O. Uzupełnić wodą do 100 ml.

3.8. Kwas chlorowodorowy, 1 mol/l

3.9. Kwas chlorowodorowy, 8 mol/l, d = 1,125 g/ml

3.10. Roztwór wodorotlenku sodowego, 10 mol/l, d = 1,33 g/ml

3.11. Wskaźnik: 0,1%(m/V) roztwór oranżu metylowego

3.12. Sproszkowana pankreatyna - zgodnie z (8). Przechowywać w zamkniętej kolbie, chroniąc przed światłem i wilgocią.

3.13. Odczynnik Luff-Schoorla. Dodać roztwór kwasu cytrynowego (3.13.2.) do roztworu węglanu sodu (3.13.3), ostrożnie mieszając podczas dodawania. Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (3.13.1) i uzupełnić wodą do 1l. Zostawić na noc i przesączyć. Sprawdzić stężenie molowe otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l (0,1 N), Na₂CO₃ 1 mol/l (2 N)). pH roztworu powinno wynosić około 9,4.

3.13.1. Roztwór siarczanu miedzi(II): rozpuścić 25 g siarczanu miedzi(II) CuSO₄ x 5H₂O w 100 ml wody.

3.13.2. Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego C₆H₈O₇ x H₂O w 50 ml wody

3.13.3. Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w 300 ml gorącej wody. Ochłodzić.

3.14. Granulki pumeksu oczyszczone przez gotowanie w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.15. Jodek potasowy, 30% (w/v) roztwór

3.16. Kwas siarkowy około 3 mol/l, d = 1,18 g/ml

3.17. Roztwór tiosiarczanu(VI) sodu 0,05 mol/l (0,1 N)

3.18. Roztwór skrobi: do 1 litra wrzącej wody dodać mieszaninę składającą się z 5 g skrobi rozpuszczonej w 30 ml wody.

Gotować 3 minuty, pozostawić do ochłodzenia. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Ekstraktor (rys. 3) składający się z:

4.1.1. Kolba stożkowa o pojemności 500 ml, z szeroką szyjką

4.1.2. Chłodnica zwrotna przymocowana do kolby poprzez zatyczkę

4.1.3. Ruchomy drut umocowany na sztywno, przechodzący przez środek chłodnicy i zakończony hakiem o odpowiednim kształcie

4.1.4. Metalowy uchwyt do zawieszania i podtrzymywania na haku tygla do filtracji (4.1.5)

4.1.5. Tygiel filtracyjny do szybkiej filtracji: maksymalny rozmiar porów od 90 do 150 mikronów (np. porowatość jeden), o pojemności około 30 ml

4.1.6. Bibuła filtracyjna kształtem i rozmiarem dopasowana do tygla filtracyjnego

4.2. Cieplarka nastawiona na temperaturę 38°C

4.3. Kolby miarowe o pojemności 200 ml, ze szlifem i chłodnicą zwrotną

4.4. Kolby miarowe ze szlifem, o pojemności 100 ml, z chłodnicą zwrotną

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki

Próbkę rozdrobnić tak, aby w całości przeszła przez sito o oczkach 0,5 mm.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2 g próbki i umieścić ją w tyglu filtracyjnym (4.1.5), którego spód uprzednio wyścielono bibułą filtracyjną (4.1.6) zwilżoną etanolem (3.1). Umieścić w kolbie stożkowej (4.1.1) 55 ml etanolu (3.1) i wrzucić kilka granulek pumeksu. Tygiel umieścić w metalowym uchwycie i zawiesić na haku (4.1.3). Przyłączyć chłodnicę zwrotną do kolby tak, aby dno tygla dotykało powierzchni etanolu. Usztywnić konstrukcję w tej pozycji. Doprowadzić etanol do wrzenia i gotować przez 3 godziny. Następnie ochłodzić i podnieść drut (4.1.3) tak, aby tygiel znajdował się jak najwyżej w kolbie stożkowej. Ostrożnie odkorkować kolbę i powoli wlać 45 ml wody po ściankach kolby. Dołączyć chłodnicę od kolby stożkowej i umocować tygiel filtracyjny 10 cm nad powierzchnią cieczy. Doprowadzić ciecz do wrzenia i gotować przez 3 godziny. Po ochłodzeniu kolbę otworzyć i wyjąć tygiel z pojemnika.

5.3. Scukrzenie i hydroliza

Dołączyć tygiel do kolby próżniowej i osuszyć pod próżnią. Pozostałość przenieść do moździerza i rozdrobnić. Przenieść ilościowo rozdrobnioną pozostałość za pomocą 60 ml wody do 200 ml kolby miarowej ze szlifem i dodać kilka kropli alkoholu amylowego (3.2). Kolbę umieścić pod chłodnicą zwrotną. Ogrzać do wrzenia i gotować godzinę. Następnie ochłodzić i odłączyć chłodnicę. Dodać 25 ml roztworu buforowego (3.4), 250 mg pankreatyny (3.12), 2,5 ml roztworu chlorku sodu (3.5) i 10 kropli toluenu (3.3). Wstrząsać przez 2 minuty, a potem umieścić kolbę w cieplarce (4.2) na 21 godzin, od czasu do czasu wstrząsając. Schłodzić do temperatury pokojowej.

Dodać 5 ml roztworu Carreza I (3.6) i wstrząsać minutę. Następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.7) i jeszcze raz wstrząsnąć. Uzupełnić wodą kolbę do kreski, wymieszać i przesączyć. Pobrać pipetą 50 ml przesączu i przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 ml (można w 200 ml kolbie umieścić 100 ml przesączu). Dodać kilka kropli wskaźnika (3.11) i zakwaszać kwasem chlorowodorowym 8 mol/l (3.9) do zmiany barwy wskaźnika na czerwoną. Następnie dodać jeszcze dodatkowo 6,25 ml kwasu chlorowodorowego 8 mol/l (3.9) (12,5 ml do 100 ml filtratu). Podłączyć chłodnicę zwrotną do kolby i gotować przez godzinę. Po ostudzeniu zobojętniać roztwór roztworem wodorotlenku sodu 10 mol/l (3.10) do zmiany barwy na żółtą. Teraz z kolei lekko zakwasić, dodając odrobinę kwasu chlorowodorowego 1 mol/l (3.8), uzupełnić kolbę do kreski wodą i wymieszać. Oznaczyć zawartość glukozy metodą Luff-Schoorla, tak jak opisano w (5.4).

5.4. Miareczkowanie z odczynnikiem Luff-Schoorla

Odmierzyć 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.13) i umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml, dodać 25 ml dokładnie odmierzonego roztworu, otrzymanego według opisu w (5.3), który nie powinien zawierać więcej niż 60 mg glukozy. Dodać dwie granulki pumeksu (3.14), ogrzewać, ręcznie wstrząsając nad płomieniem, doprowadzić do wrzenia i utrzymywać w tym stanie przez 2 minuty. Natychmiast odstawić kolbę na siatkę azbestową o średnicy 6 cm. Zapalić płomień pod siatką i zwiększać go stopniowo tak, aby tylko dno kolby było ogrzewane. Następnie dołączyć do kolby chłodnicę zwrotną i gotować dokładnie przez 10 minut. Ochłodzić w zimnej wodzie i po 5 minutach miareczkować, jak podano niżej. Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (3.15) i natychmiast po tej czynności, ale ostrożnie (ze względu na ryzyko gwałtownego pienienia się), dodać 25 ml kwasu siarkowego 3 mol/l (3.16). Miareczkować roztworem tiosiarczanu(VI) sodu 0,05 mol/l (3.17) do momentu pojawienia się bladożółtej barwy i wtedy dodać kilka kropli wskaźnika skrobiowego (3.8), i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić miareczkowanie mieszaniny: 25 ml dokładnie odmierzonego odczynnika Luff-Schoorla (3.13), 25 ml wody z dodatkiem 10 ml roztworu jodku potasu (3.15) i 25 ml 3 mol/l kwasu siarkowego (3.16) bez doprowadzania roztworu do wrzenia.

5.5. Ślepa próba

Postępując, jak podano w (5.3) i (5.4), dokonać analizy bez dodatku analizowanej próbki.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Z tabeli 2 odczytać zawartość glukozy na podstawie różnicy między dwoma miareczkowaniami z udziałem próbki (wyrażonej w ml 0,05 mol/l (0,1 N) tiosiarczanu(VI) sodu) oraz z uwzględnieniem ślepej próby.

Procentową zawartość skrobi w próbce obliczyć według poniższego wzoru:

0,72 x (a - b),

gdzie:

a -  ilość glukozy, w mg, odpowiadająca próbce,

b -  ilość glukozy, w mg, odpowiadająca ślepej próbie (ilość glukozy w ślepej próbie wynosi zwykle 0,25 mg, nie powinna być ona wyższa od 0,50 mg).

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Jeżeli częściowo lub całkowicie dekstrynowana skrobia i laktoza są obecne w próbce, wyniki mogą być zawyżone od 0,5 do 3%. W takim przypadku skrobię oznaczamy w poniższy sposób:

(a)  Oznaczyć zawartość cukrów redukcyjnych w etanolowym ekstrakcie otrzymanym w (5.2) i wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy;

(b)  Określić zawartość cukrów redukujących rozpuszczalnych w wodzie w próbce, a wynik przeliczyć na procentową zawartość glukozy;

(c)  Wynik z (a) odjąć od wyniku (b) i różnicę pomnożyć przez 0,9;

(d)  Wartość uzyskaną w (c) odjąć od zawartości skrobi przy zastosowaniu metody i wzoru z (6).

7.2. Ilość glukozy w ślepej próbie wynosi zwykle 0,25 mg. Nie powinna być ona wyższa od 0,50 mg.

8. WSKAZÓWKI DOTYCZĄCE PANKREATYNY

Właściwości fizyczne: żółtobiały amorficzny proszek

Zawartość glukozy: ilość glukozy w ślepej próbie wynosi zwykle 0,25 mg (postępując jak w (5.3) i (5.4), dokonać analizy bez dodatku analizowanej próbki). Wynik wyższy od 0,50 mg wskazuje, że pankreatyna nie powinna być dłużej używana. Próba na zużycie jodu: rozprowadzić 62,5 mg pankreatyny w około 50 ml wody podgrzanej do temperatury 24 - 30°C. Dodać 1 ml roztworu jodu 0,1 mol/l (0,1 N). Mieszać 2 minuty. Miareczkować 0,1 N roztworem tiosiarczanu sodowego (0,05 mol/l) w obecności wskaźnika skrobiowego. Zużycie roztworu jodu przez pankreatynę nie może przekraczać 0,5 ml. Próba na aktywność amylolityczną: zmieszać 100 ml roztworu skrobi (3.18), 5 ml roztworu buforowego (3.4), 0,5 ml roztworu chlorku sodowego (3.5) i 62,5 mg pankreatyny. Podgrzać mieszaninę do temperatury 25 - 30°C, mieszać przez 2 minuty. Dodać 1 ml 0,1 mol/l roztworu jodu. Niebieskie zabarwienie powinno zniknąć dokładnie po 15 minutach od momentu dodania roztworu jodu.

Tabela 2. Wartości dla 25 ml odczynnika Luff-Schoorla

ml Na₂S₂O₃ 0,05 mol/l (0,1 N), dwie minuty ogrzewania, dziesięć minut gotowania

 

Na2S2O3 0,1 N	Glukoza, fruktoza, cukry inwertowane C6H12O6		Laktoza C12H22O11		Maltoza C12H22O11		Na2S2O3 0,1 N
ml	mg	różnica	mg	różnica	mg	różnica	ml
1	2,4	2,4	3,6	3,7	3,9	3,9	1
2	4,8	2,4	7,3	3,7	7,8	3,9	2
3	7,2	2,5	11,0	3,7	11,7	3,9	3
4	9,7	2,5	14,7	3,7	15,6	4,0	4
5	12,2	2,5	18,4	3,7	19,6	3,9	5
6	14,7	2,5	22,1	3,7	23,5	4,0	6
7	17,2	2,6	25,8	3,7	27,5	4,0	7
8	19,8	2,6	29,5	3,7	31,5	4,0	8
9	22,4	2,6	33,2	3,8	35,5	4,0	9
10	25,0	2,6	37,0	3,8	39,5	4,0	10
11	27,6	2,7	40,8	3,8	43,5	4,0	11
12	30,3	2,7	44,6	3,8	47,5	4,1	12
13	33,0	2,7	48,4	3,8	51,6	4,1	13
14	35,7	2,8	52,2	3,8	55,7	4,1	14
15	38,5	2,8	56,0	3,9	59,8	4,1	15
16	41,3	2,9	59,9	3,9	63,9	4,1	16
17	44,2	2,9	63,8	3,9	68,0	4,2	17
18	47,1	2,9	67,7	4,0	72,2	4,3	18
19	50,0	3,0	71,7	4,0	76,5	4,4	19
20	53,0	3,0	75,7	4,1	80,9	4,5	20
21	56,0	3,1	79,8	4,1	85,4	4,6	21
22	59,1	3,1	83,9	4,1	90,0	4,6	22
23	62,2		88,0		94,6		23

 

grafika

rys. 3 Ekstraktor

2.11. OZNACZANIE CUKRÓW

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości cukrów redukujących i całkowitej zawartości cukrów po inwersji wyrażonych jako glukoza lub w razie potrzeby w przeliczeniu na sacharozę. W tym ostatnim przypadku do przeliczania stosujemy współczynnik 0,95. Metoda jest stosowana do mieszanek paszowych. Dla innych pasz stosujemy specjalne metody. Laktozę mierzy się oddzielnie, uwzględniając w końcowych obliczeniach.

2. ZASADA METODY

Cukry wyekstrahowane rozcieńczonym etanolem klaruje się roztworami Carreza I i II. Po wyeliminowaniu etanolu zawartość cukrów przed i po inwersji oznacza się metodą Luff-Schoorla.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Etanol, 40% (V/V), d = 0,949 g/ml przy temperaturze 20°C, obojętny wobec fenoloftaleiny

3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn(CH₃COOH)₂ x 2H₂O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Dopełnić wodą do 100 ml.

3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g heksacyjanożelazianu(II) potasu K₄Fe(CN)₆ x 3H₂O. Uzupełnić do 100 ml wodą.

3.4. Roztwór 0,1% (w/v) oranżu metylowego

3.5. Kwas chlorowodorowy 4 mol/l

3.6. Kwas chlorowodorowy 0,1 mol/l

3.7. Roztwór wodorotlenku sodu 0,1 mol/l

3.8. Odczynnik Luff-Schoorla. Dodać roztwór kwasu cytrynowego (3.8.2) do roztworu węglanu sodu (3.8.3), ostrożnie mieszając podczas dodawania. Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (3.8.1) i uzupełnić wodą do 1l. Zostawić na noc i przesączyć. Sprawdzić normalność otrzymanego odczynnika (Cu 0,05 mol/l (0,1 N), Na₂CO₃ 1 mol/l (2N)). pH roztworu powinno wynosić około 9,4.

3.8.1. Roztwór siarczanu miedzi: rozpuścić 25 g siarczanu miedzi CuSO₄ x 5H₂O w 100 ml wody.

3.8.2. Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego C₆H₈O₇ x H₂O w 50 ml wody.

3.8.3. Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w 300 ml gorącej wody. Ochłodzić.

3.9. Roztwór tiosiarczanu(VI) sodu 0,1 N

3.10. Roztwór skrobi: do 1 litra wrzącej wody dodać mieszaninę składającą się z 5 g rozpuszczonej skrobi w 30 ml wody

Gotować 3 minuty, pozostawić do ochłodzenia. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem

3.11. Kwas siarkowy około 3 mol/l, d = 1,18 g/ml

3.12. 30% (w/v) roztwór jodku potasu

3.13. Granulki pumeksu oczyszczone przez gotowanie w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.14. 3-metylobutanol

4. APARATURA I SPRZĘT

Mieszarka obrotowa o około 35 - 40 obr/min

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja próbki

Odważyć 2,5 g próbki, z dokładnością do 1 mg, i umieścić w 250 ml kolbie miarowej. Dodać 200 ml etanolu (3.1), mieszać w mieszarce bębnowej przez 1 godzinę. Dodać 5 ml roztworu Carreza I (3.2) i mieszać przez 1 minutę. Dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.3) i ponownie mieszać przez 1 minutę. Uzupełnić kolbę etanolem (3.1) do kreski, wymieszać i przesączyć. Pobrać 200 ml filtratu i odparować do połowy objętości w celu usunięcia większości etanolu. Przenieść ilościowo pozostałość po odparowaniu do 200 ml kolby miarowej przy użyciu gorącej wody, schłodzić, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać i, jeśli zajdzie potrzeba, przesączyć. Roztwór ten będzie dalej użyty do oznaczenia zawartości cukrów redukujących i, po inwersji, całkowitej zawartości cukrów.

5.2. Oznaczanie cukrów redukujących

Pobrać pipetą nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukujących w przeliczeniu na glukozę. Jeśli zajdzie potrzeba, uzupełnić wodą destylowaną do 25 ml i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy w próbce.

5.3. Oznaczenie całkowitej zawartości cukrów po inwersji

Przenieść pipetą 50 ml roztworu do 100 ml kolby miarowej. Dodać kilka kropli roztworu oranżu metylowego (3.4) i następnie, ostrożnie mieszając, dodawać kwas chlorowodorowy 4 mol/l (3.5) aż do zmiany barwy cieczy na czerwoną.

Dodać 15 ml kwasu chlorowodorowego 0,1 mol/l (3.6), zanurzyć kolbę w wrzącej łaźni wodnej i pozostawić przez 30 minut.

Szybko schłodzić do temperatury 20°C i dodać 15 ml roztworu 0,1 mol/l wodorotlenku sodu (3.7). Uzupełnić wodą do 100 ml i wymieszać. Pobrać nie więcej niż 25 ml roztworu zawierającego mniej niż 60 mg cukrów redukcyjnych w przeliczeniu na glukozę. Jeśli zajdzie konieczność, uzupełnić do 25 ml destylowaną wodą i oznaczyć zawartość cukrów redukujących metodą Luff-Schoorla. Wynik wyrazić jako procentową zawartość glukozy lub, mnożąc przez współczynnik 0,95, przeliczyć na sacharozę.

5.4. Miareczkować metodą Luff-Schoorla

Odmierzyć pipetą 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.8) i umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml, dodać dokładnie 25 ml klarownego roztworu cukru. Dodać 2 granulki pumeksu (3.13), ogrzewać nad płomieniem, ręcznie mieszając, i doprowadzić ciecz do wrzenia w około 2 minuty. Natychmiast postawić kolbę na siatce azbestowej o średnicy 6 cm i zapalić pod nią płomień. Płomień powinien być tak ustawiony, aby ogrzewane było tylko dno kolby. Nałożyć na kolbę chłodnicę zwrotną. Gotować dokładnie 10 minut. Schłodzić zimną wodą i po 5 minutach miareczkować.

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (3.12) i od razu po tej czynności (ale ostrożnie ze względu na ryzyko powstania piany) dodać 25 ml kwasu siarkowego (3.11). Miareczkować 0,05 mol/l roztworem tiosiarczanu(VI) sodu (3.9) do zmiany barwy na żółtą, dodać wskaźnik skrobiowy (3.10) i dokończyć miareczkowanie.

Przeprowadzić takie samo miareczkowanie, odmierzając dokładnie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla i mieszając z 25 ml wody, następnie dodając 10 ml roztworu jodku potasu (3.12) i 25 ml kwasu siarkowego 3 mol/l (3.11) bez gotowania. Miareczkować roztworem tiosiarczan(VI) sodu 0,05 mol/l (0,1 N) do uzyskania matowożółtego zabarwienia, dodać wskaźnik skrobiowy (3.10) i dokończyć miareczkowanie.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Wykorzystując tabelę 2, określić ilość glukozy w mg, która odpowiada różnicy między wynikami z dwóch miareczkowań, wyrażonych w mg zużytego roztworu tiosiarczanu(VI) sodu 0,1 N. Wynik wyrazić w procentach wagowych.

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. W przypadku pasz bogatych w melasę i innych pasz, zwłaszcza niejednorodnych, odważyć 20 g próbki i umieścić z 500 ml wody w kolbie miarowej o pojemności 1 litra. Mieszać przez godzinę w mieszarce bębnowej. Sklarować odczynnikami Carreza I (3.2) i Carreza II (3.3), tak jak to opisano w (5.1), przy zastosowaniu czterokrotnie większych ilości każdego odczynnika. Uzupełnić do kreski 80% etanolem (V/V). Wymieszać i przesączyć. Odparować etanol, tak jak opisano w (5.1). Jeśli w roztworze nie ma dekstrynowanej skrobi, uzupełnić do kreski wodą destylowaną.

7.2. W przypadku melasy i prostych surowców paszowych bogatych w cukier i prawie pozbawionych skrobi (strąki drzewa Ceratonia siliqua, suszone końcówki buraków cukrowych) odważyć 5 g próbki. Próbkę umieścić w 250 ml kolbie miarowej, dodać 200 ml wody destylowanej, wymieszać w mikserze przez godzinę lub dłużej w razie konieczności. Roztwór klarować odczynnikami Carreza I (3.1) i Carreza II (3.3), tak jak opisano w (5.1). Uzupełnić kolbę do kreski zimną wodą, wymieszać i przesączyć. Aby określić całkowitą zawartość cukrów, postępować dalej, jak podano w (5.3).

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Aby zapobiec powstawaniu piany, wskazane jest dodanie (niezależnie od objętości roztworu) około 1 ml 3-metylobutano-1-olu (3.14) przed gotowaniem z odczynnikiem Luff-Schoorla.

8.2. Różnica pomiędzy zawartością całkowitą cukrów po inwersji, w przeliczeniu na glukozę, a zawartością cukrów redukujących, w przeliczeniu na glukozę, pomnożona przez 0,95 daje procentową zawartość sacharozy.

8.3. W przypadku oznaczania zawartości cukrów redukujących, z wyłączeniem laktozy, można zastosować poniższe dwie metody:

8.3.1. Dla szacunkowych obliczeń pomnożyć zawartość laktozy oznaczoną inną metodą przez 0,675 i odjąć od wyniku oznaczania zawartości cukrów redukujących.

8.3.2 Aby dokładnie obliczyć zawartość cukrów redukujących, z wyłączeniem laktozy, ta sama próbka musi być użyta do dwu końcowych oznaczeń. Jedną analizę przeprowadza się na części roztworu otrzymanego w (5.1), drugą na części roztworu otrzymanego podczas oznaczania laktozy metodą służącą do jej oznaczania (po fermentacji innych rodzajów cukrów i sklarowaniu).

W obu przypadkach ilość cukru jest oznaczana metodą Luff-Schoorla i przeliczana na mg glukozy. Jedna wartość jest odejmowana od drugiej i różnica jest wyrażana w procentach wagowych.

Przykład

Dwie pobrane objętości roztworu do dwóch oznaczeń odpowiadają masie próbki 250 mg.

W pierwszym przypadku 17 ml 0,1 N roztworu tiosiarczanu(VI) sodu odpowiada 44,2 mg zużytej glukozy, w drugim 11 ml odpowiada 27,6 mg glukozy.

Różnica wynosi 16,6 mg glukozy.

Zawartość cukrów redukujących (z wyłączeniem laktozy), w przeliczeniu na glukozę, wynosi:

4 x 16,6

---------- = 6,64%.

   10

2.12. OZNACZANIE LAKTOZY

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości laktozy w paszach zawierających ponad 0,5% laktozy.

2. ZASADA METODY

Cukry są rozpuszczane w wodzie, a roztwór poddawany jest fermentacji w obecności drożdży Saccharomyces cervevisae, które nie rozkładają laktozy. Po sklarowaniu i przesączeniu zawartość laktozy w filtracie oznaczana jest metodą Luff-Schoorla.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Zawiesina drożdży Saccharomyces cervevisae: 25 g świeżych drożdży rozprowadzić w 100 ml wody. Zawiesinę przechowywać w lodówce nie dłużej niż przez okres jednego tygodnia od jej sporządzenia.

3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn(CH₃COOH)₂ x 2H₂O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Dopełnić wodą do 100 ml.

3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g trihydratu heksacyjanożelazianu(II) tetrapotasu [K₄Fe(CN)₆] x 3H₂O. Uzupełnić wodą do 100 ml.

3.4. Odczynnik Luff-Schoorla. Ostrożnie mieszając, dodać roztwór kwasu cytrynowego (3.4.2.) do roztworu węglanu sodu (3.4.3). Następnie dodać roztwór siarczanu miedzi (3.4.1) i uzupełnić wodą do 1l. Zostawić na noc do osadzenia i przesączyć. Sprawdzić normalność otrzymanego odczynnika (Cu (II) 0,05 mol/l (0,1 N), Na₂CO₃ 1 mol/l (2 N)). pH roztworu powinno wynosić około 9,4.

3.4.1. Roztwór siarczanu miedzi: rozpuścić 25 g siarczanu miedzi CuSO₄ x 5H₂O w 100 ml wody.

3.4.2. Roztwór kwasu cytrynowego: rozpuścić 50 g kwasu cytrynowego C₆H₈O₇ x H₂O w 50 ml wody.

3.4.3. Roztwór węglanu sodu: rozpuścić 143,8 g bezwodnego węglanu sodu w 300 ml gorącej wody. Pozostawić do schłodzenia.

3.5. Granulki pumeksu gotowane w kwasie chlorowodorowym, przemyte wodą i wysuszone

3.6. Jodek potasu, roztwór 30% (m/V)

3.7. Kwas siarkowy o stężeniu 3 mol/l (6 N)

3.8. Tiosiarczan sodu, roztwór 0,05 mol/l (0,1N)

3.9. Roztwór skrobi: dodać mieszaninę składającą się z 5 g skrobi rozpuszczonej w 30 ml wody do 1 litra wrzącej wody.

Gotować przez trzy minuty, pozostawić do ochłodzenia, dodać 10 mg jodku rtęci jako środka konserwującego.

4. APARATURA I SPRZĘT

Łaźnia wodna z termostatem ustawiona na temperaturę 38 - 40°C

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Odważyć 1 g próbki, z dokładnością do 1 mg, i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Dodać 25 do 30 ml wody.

5.2. Umieścić kolbę na wrzącej łaźni wodnej i utrzymywać przez 30 minut, a następnie schłodzić do około 35°C. Dodać 5 ml zawiesiny drożdży (3.1) i wymieszać. Pozostawić kolbę na 2 godziny na łaźni wodnej o temperaturze 38 - 40°C. Schłodzić do około 20°C. Dodać 2,5 ml roztworu Carreza I (3.2) i mieszać przez 30 sekund, następnie dodać 2,5 ml roztworu Carreza II (3.3) i ponownie mieszać przez 30 sekund. Uzupełnić do 100 ml wodą, wymieszać i przesączyć. Pobrać pipetą ilość filtratu nie większą niż 25 ml, która zawiera od 40 do 80 mg laktozy i umieścić ją w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml.

W miarę potrzeby uzupełnić wodą do 25 ml. Przeprowadzić test ślepej próby z 5 ml zawiesiny drożdżowej (3.1).

5.3. Oznaczyć zawartość laktozy według Luff-Schoorla, jak opisano dalej. Dodać dokładnie 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.4) i dwie granulki pumeksu (3.5). Wstrząsnąć ręcznie podczas ogrzewania nad płomieniem, doprowadzić do wrzenia i gotować około 2 minuty. Natychmiast odstawić kolbę Erlenmeyera na siatkę azbestową o średnicy 6 cm. Zapalić płomień pod siatką i zwiększać go stopniowo tak, aby tylko dno kolby Erlenmeyera było ogrzewane. Następnie nałożyć na kolbę Erlenmeyera chłodnicę zwrotną i gotować dokładnie przez 10 minut. Szybko schłodzić w zimnej wodzie i po około 5 minutach miareczkować w następujący sposób.

Dodać 10 ml roztworu jodku potasu (3.6) i natychmiast po tej czynności, ale ostrożnie (ze względu na ryzyko gwałtownego pienienia się), dodać 25 ml kwasu siarkowego 3 mol/l (3.7). Miareczkować 0,05 mol/l (0,1 N) roztworem tiosiarczanu sodowego (3.8), dopóki nie pojawi się blady żółty kolor, następnie dodać kilka kropli wskaźnika skrobiowego (3.9) i dokończyć miareczkowanie.

5.4. Przeprowadzić takie samo miareczkowanie z dokładnie sporządzoną mieszaniną 25 ml odczynnika Luff-Schoorla (3.4), 25 ml wody, 10 ml roztworu jodku potasu (3.6) i 25 ml kwasu siarkowego 3 mol/l (3.7) bez doprowadzania roztworu do wrzenia.

5.5. Test ślepej próby

Przy użyciu tej samej metody wykonać analizę bez próbki.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Wykorzystując tabelę 2, odczytać zawartość laktozy w mg, która odpowiada różnicy pomiędzy wynikami dwu miareczkowań, wyrażonych w ml roztworu tiosiarczanu sodu 0,1 N.

Wynik przedstawić w procentach wagowych laktozy w próbce.

7. OBJAŚNIENIA

Dla produktów zawierających ponad 40% fermentujących cukrów dodać więcej niż 5 ml zawiesiny drożdży (3.1).

Rozdział 3

BADANIE AMINOKWASÓW

3.1. OZNACZANIE AMINOKWASÓW

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania wolnych (syntetycznych i naturalnych) oraz całkowitych (związanych jako peptydy i wolnych) aminokwasów w paszach przy użyciu analizatora aminokwasów. Metoda ma zastosowanie do następujących aminokwasów: cystyny (cysteiny), metioniny, lizyny, treoniny, alaniny, argininy, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, tyrozyny i waliny. Metoda nie pozwala odróżnić soli aminokwasów, a także form D i L aminokwasów. Nie można jej stosować do oznaczania tryptofanu i hydroksy analogów aminokwasów.

2. ZASADA METODY

2.1. Wolne aminokwasy

Wolne aminokwasy są ekstrahowane rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Wyekstrahowane jednocześnie makrocząsteczki związków azotowych są wytrącane kwasem sulfosalicylowym i usuwane przez filtrowanie. Filtrowany roztwór jest doprowadzany do pH 2,2. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i, po reakcji z ninhydryną, oznaczane poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm.

2.2. Aminokwasy całkowite

Wybór sposobu postępowania zależy od oznaczanych aminokwasów. Cystynę (cysteinę) i metioninę należy przed hydrolizą poddać utlenianiu, odpowiednio do kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny. Tyrozyna powinna być oznaczana w hydrolizatach niepoddanych utlenieniu. Wszystkie inne aminokwasy wymienione w punkcie 1 mogą być oznaczane w próbce utlenionej lub niepoddanej utlenianiu.

Utlenianie jest przeprowadzane w temperaturze 0°C przy użyciu mieszaniny kwasu nadmrówkowego i fenolu. Nadmiar odczynnika utleniającego jest rozkładany za pomocą disiarczku sodu. Utleniona lub niepoddana utlenianiu próbka jest hydrolizowana kwasem chlorowodorowym (c = 6 mol/l) przez 23 godziny. Hydrolizat jest doprowadzany do pH 2,2.

Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i, po reakcji z ninhydryną, oznaczane poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm (440 nm w przypadku proliny).

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Należy stosować wodę redestylowaną lub podobnej czystości (przewodność < 10 µS).

3.1. Nadtlenek wodoru, w = 30%

3.2. Kwas mrówkowy, w = 98 - 100%

3.3. Fenol

3.4. Disiarczek sodu

3.5. Wodorotlenek sodu

3.6. Kwas 5-sulfosalicylowy dihydrat

3.7. Kwas solny, gęstość około 1,18 g/ml

3.8. Cytrynian trisodu, dihydrat

3.9. 2,2' Tiodietanol (tiodiglikol)

3.10. Chlorek sodu

3.11. Ninhydryna

3.12. Eter naftowy, temperatura wrzenia 40 - 60°C

3.13. Norleucyna lub inny związek odpowiedni do stosowania jako wzorzec wewnętrzny

3.14. Azot (<10 ppm tlenu)

3.15. 1-oktanol

3.16. Aminokwasy

3.16.1. Standardowe substancje wymienione w (1). Czyste związki, niezawierające wody krystalizacyjnej, suszone pod próżnią w obecności P₂O₅ lub H₂SO₄ przez okres jednego tygodnia przed użyciem.

3.16.2. Kwas cysteinowy

3.16.3. Sulfon metioniny

3.17. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 7,5 mol/l: rozpuścić 300 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 litra.

3.18. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l

Rozpuścić 40 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 litra.

3.19. Roztwór wodny kwasu mrówkowego i fenolu

Zmieszać 889 g kwasu mrówkowego (3.2) z 111 g wody i dodać 4,73 g fenolu (3.3).

3.20. Mieszanina hydrolizująca, c = 6 mol HCl/l, zawierająca 1 g fenolu/l:

Dodać 1 g fenolu (3.3) do 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić do 1 litra wodą.

3.21. Mieszanina ekstrakcyjna, c = 0,1 mol HCl/l, zawierająca 2% tiodiglikolu:

Pobrać 8,2 ml HCl (3.7), rozpuścić w około 900 ml wody, dodać 20 ml tiodiglikolu (3.9) i uzupełnić do 1 litra wodą (nie mieszać bezpośrednio odczynników (3.7) i (3.9)).

3.22. Kwas 5-sulfosalicylowy, p = 6%:

Rozpuścić 60 g kwasu 5-sulfosalicylowego (3.6) w wodzie i uzupełnić do 1 litra wodą.

3.23. Mieszanina utleniająca (kwas nadmrówkowy - fenol)

Zmieszać w małej zlewce 0,5 ml nadtleneku wodoru (3.1) z 4,5 ml wodnego roztworu kwasu mrówkowego i fenolu (3.19). Utrzymywać w temperaturze 20 - 30°C przez 1 godzinę w celu utworzenia kwasu nadmrówkowego, następnie ochłodzić w wodnej łaźni lodowej (15 minut) przed dodaniem do próbki.

Unikać kontaktu ze skórą i nosić odzież ochronną.

3.24. Bufor cytrynianowy, c = 0,2 mol Na⁺ /1, pH 2,20:

Rozpuścić 19,61 g cytrynianu sodowego (3.8), 5 ml tiodiglikolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) i 16,50 ml HCl (3.7) w około 800 ml wody. Doprowadzić do pH 2,20. Uzupełnić do 1 litra wodą.

3.25. Bufor wymywający, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (4.9)

3.26. Odczynnik ninhydrynowy, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (4.9)

3.27. Standardowe roztwory aminokwasów. Roztwory należy przechowywać w temperaturze poniżej 5°C.

3.27.1. Podstawowy standardowy roztwór aminokwasów (3.16.1), każdy o stężeniu c = 2,5 µmol/ml, w kwasie chlorowodorowym. Mogą być zakupione gotowe wzorce.

3.27.2. Podstawowe standardowe roztwory kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny, c = 1,25 µmola/l

Rozpuścić 0,2115 g kwasu cysteinowego (3.16.2) i 0,2265 sulfonu metioniny (3.16.3) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie pomiarowej o pojemności 1l i uzupełnić do kreski buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze poniżej 5°C nie dłużej niż 12 miesięcy. Tego roztworu nie należy przygotowywać, gdy podstawowy standardowy roztwór (3.27.1) zawiera kwas cysteinowy i sulfon metioniny.

3.27.3. Podstawowy standardowy roztwór wzorca wewnętrznego, np. norleucyna, c = 20 µmol/l

Rozpuścić 0,6560 g norleucyny (3.13) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie pomiarowej i uzupełnić do 250 ml buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze poniżej 5°C przez okres nie dłuższy niż 6 miesięcy.

3.27.4. Kalibracyjny roztwór standardu aminokwasów do użycia z hydrolizatami, c = 5 nmol/50 µl kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny i c = 10 nmol/50 µl w przypadku innych aminokwasów

Rozpuścić 2,2 g chlorku sodu (3.10) w zlewce o pojemności 100 ml z 30 ml buforu cytrynianowego (3.24). Dodać 4,00 ml podstawowego roztworu standardowego aminokwasów (3.27.1), 4,00 ml podstawowego roztworu standardowego kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny (3.27.2) i, jeżeli jest stosowany, 0,50 ml podstawowego roztworu standardowego wzorca wewnętrznego aminokwasów (3.27.3). Doprowadzić do pH 2,20 za pomocą wodorotlenku sodu (3.18). Przenieść ilościowo do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do kreski buforem cytrynianowym (3.24) i wymieszać. Przechowywać w temperaturze poniżej 5°C nie dłużej niż 3 miesiące. Z powodu różnic pomiędzy analizatorami aminokwasów podawane tu końcowe stężenia wzorcowych roztworów kalibracyjnych aminokwasów ((3.27.4) i (3.27.5)) i hydrolizatu (5.3.4) należy traktować jako przykładowe.

Zakres liniowej odpowiedzi aparatu powinien zostać sprawdzony dla wszystkich aminokwasów.

Wzorcowy roztwór jest rozcieńczany buforem cytrynianowym tak, aby otrzymać pik o średniej powierzchni.

3.27.5. Kalibracyjny roztwór standardu aminokwasów do stosowania z hydrolizatami przygotowanymi zgodnie z (5.3.3.1) i do użycia z ekstraktami (5.2). Roztwór kalibracyjny przygotowywać zgodnie z (3.27.4) z pominięciem chlorku sodu. Przechowywać w temperaturze poniżej 5°C nie dłużej niż 3 miesiące.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolba okrągłodenna o pojemności 100 lub 250 ml, z chłodnicą zwrotną

4.2. Butelka ze szkła borokrzemowego, o pojemności 100 ml, z nakrętką pokrytą gumą/teflonem (np. Duran, Schott), do stosowania w suszarce

4.3. Suszarka z silnym nawiewem i możliwością regulacji temperatury z dokładnością powyżej ±2°C

4.4. Pehametr (dokładność trzy miejsca dziesiętne po przecinku)

4.5. Filtr membranowy (0,2 µm)

4.6. Wirówka

4.7. Obrotowa wyparka próżniowa

4.8. Mieszadło magnetyczne lub wstrząsarka mechaniczna

4.9. Analizator aminokwasów lub wyposażenie do HPLC z kolumną jonowymienną, z przystawką do ninhydryny, postkolumnową derywatyzacją i detektorem fotometrycznym

Kolumna jest wypełniona sulfonowaną żywicą polistyrenową mającą zdolność rozdziału aminokwasów od siebie i od innych składników reagujących z ninhydryną. Przepływ buforu i ninhydryny przyprowadzany jest przez pompy o stabilności przepływu ±0,5% w czasie testowania roztworów kalibracyjnych, jak i analizy próbek.

W niektórych analizatorach aminokwasów mogą być stosowane metody hydrolizy, w których hydrolizat zawiera stężenie sodu c = 0,8 mol/l i zawiera całą pozostałość kwasu mrówkowego z etapu utleniania. Inne analizatory nie dają zadawalającego rozdziału niektórych aminokwasów, jeżeli hydrolizat zawiera nadmiar kwasu mrówkowego i/lub wysokie stężenie jonów sodowych. W tym przypadku objętość kwasu jest zmniejszana przez odparowanie próbki po hydrolizie do objętości około 5 ml, przed ustawieniem pH. Odparowywanie powinno być prowadzone pod próżnią w temperaturze maksymalnie 40°C.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbek

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez sito 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgoci należy przed rozdrobnieniem wysuszyć w temperaturze nieprzekraczającej 50°C lub przez liofilizację. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.12) przed rozdrabnianiem.

5.2. Oznaczanie wolnych aminokwasów w paszach i premiksach

Zważyć, z dokładnością do 0,2 mg, odpowiednią ilość (1 - 5 g) przygotowanej próbki (5.1) do kolby stożkowej i dodać 100,0 ml mieszaniny ekstrakcyjnej (3.21). Wstrząsać zawartość przez 60 minut, używając wstrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (4.8). Odstawić do sedymentacji osadu i pobrać pipetą 10,0 ml roztworu znad osadu do zlewki o pojemności 100 ml. Dodać, mieszając, 5,0 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego (3.22) i kontynuować mieszanie przy użyciu mieszadła magnetycznego przez 5 minut. Przesączyć lub odwirować roztwór w celu usunięcia osadu. Umieścić 10,0 ml otrzymanego roztworu w zlewce o pojemności 100 ml, doprowadzić pH do 2,20 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (3.18), przenieść ilościowo do kolby o odpowiedniej objętości, używając buforu cytrynianowego (3.24) i uzupełnić do kreski buforem cytrynianowym (3.24). Jeżeli stosowany jest wzorzec wewnętrzny, należy dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) na każde 100 ml końcowego roztworu i uzupełnić do kreski roztworem buforowym (3.24).

Przeprowadzić rozdział chromatograficzny zgodnie z (5.4.) Jeżeli ekstrakty nie będą oznaczane tego samego dnia, należy je przechowywać w temperaturze poniżej 5°C.

5.3. Oznaczanie całkowitej zawartości aminokwasów

5.3.1. Utlenianie

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g przygotowanej próbki (5.1) do:

-   kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml (4.1) do hydrolizy otwartej (5.3.2.3) lub

-   kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (4.1) w przypadku, gdy wymagana jest niska koncentracja sodu (5.3.3.1), lub

-   butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (4.2) (do hydrolizy zamkniętej (5.3.2.4)).

Odważona próbka analityczna powinna zawierać około 10 mg azotu, a zawartość wilgoci nie powinna przekraczać 100 mg. Umieścić kolbę lub butelkę na łaźni lodowej i oziębić do temperatury 0°C, dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (3.2.3), mieszając szklaną bagietką z wygiętym końcem. Uszczelnić kolbę lub butelkę wraz bagietką za pomocą obciskającej folii nieprzepuszczającej powietrza, umieścić wraz z łaźnią lodową w lodówce o temperaturze 0°C i pozostawić na 16 godzin. Po 16 godzinach wyjąć z lodówki i rozłożyć nadmiar odczynnika utleniającego przez dodanie 0,84 g disiarczku sodu (3.4). Postępować jak w (5.3.2.1).

5.3.2. Hydroliza

5.3.2.1. Hydroliza próbek utlenionych

Do utlenionej próbki przygotowanej zgodnie z (5.3.1) dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20), zwracając uwagę, aby zmyć pozostałości próbki przywierające do bocznych ścianek naczynia lub bagietki. W zależności od sposobu hydrolizy postępować zgodnie z (5.3.2.3) lub (5.3.2.4).

5.3.2.2. Hydroliza próbek nieutlenionych

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g przygotowanej próbki (5.1) do kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml lub 250 ml (4.1) lub do butelki z nakrętką o pojemności 100 ml (4.2). Odważona próbka analityczna powinna zawierać około 10 mg azotu. Ostrożnie dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20) i wymieszać z próbką. Postępować zgodnie z (5.3.2.3) lub (5.3.2.4).

5.3.2.3. Hydroliza otwarta

Dodać trzy szklane perełki do mieszaniny w kolbie (przygotowanej zgodnie z (5.3.2.1) lub (5.3.2.2) i gotować pod chłodnicą zwrotną przez 23 godziny. Po zakończonej hydrolizie przemyć chłodnicę od góry 5 ml buforu cytrynianowego (3.24). Odłączyć kolbę i oziębić na łaźni lodowej. Postępować zgodnie z (5.3.3).

5.3.2.4. Hydroliza zamknięta

Umieścić butelkę zawierającą mieszaninę przygotowaną zgodnie z (5.3.2.1) lub (5.3.2.2) w suszarce (4.3) w temperaturze 110°C. W czasie pierwszej godziny hydrolizy, w celu uniknięcia gwałtownego wzrostu ciśnienia (z powodu powstawania substancji gazowych) i wybuchu, umieścić nakrętkę na naczyniu. Nie zamykać naczynia. Po godzinie zakręcić nakrętkę i pozostawić w suszarce (4.3) przez 23 godziny. Po zakończeniu hydrolizy wyjąć butelkę z suszarki, ostrożnie odkręcić nakrętkę i umieścić butelkę na łaźni lodowej. Pozostawić do ochłodzenia.

W zależności od sposobu ustawiania pH (5.3.3.) przenieść ilościowo zawartość butelki do zlewki o pojemności 250 ml lub kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml, stosując bufor cytrynianowy (3.24). Postępować zgodnie z (5.3.3).

5.3.3. Ustawianie pH

W zależności od tolerancji analizatora aminokwasów (4.9) na sód, ustawiać pH zgodnie z (5.3.3.1) lub (5.3.3.2).

5.3.3.1. Dla systemów chromatograficznych (4.9) wymagających niskiego stężenia sodu: wskazane jest zastosowanie roztworu podstawowego wzorca wewnętrznego (3.27.3), gdy analizator aminokwasów wymaga niskiego stężenia sodu (gdy objętość kwasu należy zredukować). W tym przypadku dodać 2,00 ml roztworu podstawowego wzorca wewnętrznego (3.27.3) do hydrolizatu przed odparowaniem. Dodać 2 krople 1-oktanolu (3.15) do hydrolizatu otrzymanego zgodnie z (5.3.2.3) lub (5.3.2.4). Stosując wyparkę próżniową (4.7), zmniejszyć objętość do 5 - 10 ml, odparowując roztwór pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C. Jeżeli objętość roztworu zostanie niechcący zredukowana poniżej 5 ml, należy wyrzucić hydrolizat i powtórzyć analizę. Doprowadzić do pH 2,20 przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu (3.18) i postępować zgodnie z (5.3.4).

5.3.3.2. Dla wszystkich innych analizatorów aminokwasów (4.9)

Hydrolizaty otrzymane zgodnie z (5.3.2.3) lub (5.3.2.4) wstępnie zneutralizować, ostrożnie dodając, mieszając 17 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.17), zwracając uwagę, aby temperatura roztworu nie przekraczała 40°C.

Doprowadzić pH do 2,20 w temperaturze pokojowej, dodając roztwór wodorotlenku sodu (3.17), a pod koniec roztwór wodorotlenku sodu (3.18). Dalej postępować jak w (5.3.4).

5.3.4. Przygotowanie roztworu próbki do analizy chromatograficznej

Przenieść ilościowo hydrolizaty o pH ustalonym według (5.3.3.1) lub (5.3.3.2) za pomocą buforu cytrynianowego (3.24) do kolby pomiarowej o pojemności 200 ml i uzupełnić do kreski buforem (3.24).

Jeżeli wcześniej nie dodawano wzorca wewnętrznego, dodać 2,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) i uzupełnić do kreski buforem cytrynianowym (3.24). Dokładnie wymieszać. Przejść do etapu analizy chromatograficznej (5.4).

Jeżeli roztwory próbek nie będą analizowane tego samego dnia, należy je przechowywać w temperaturze poniżej 5°C.

5.4. Chromatografia

Przed analizą chromatograficzną doprowadzić ekstrakt (5.2) lub hydrolizat (5.3.4) do temperatury pokojowej. Wymieszać i przesączyć odpowiednią ilość roztworu przez sączek membranowy 0,2 µm (4.5). Otrzymany klarowny roztwór jest przeznaczony do chromatografii jonowymiennej przy wykorzystaniu analizatora aminokwasów (4.9).

Dozowanie może być dokonane ręcznie lub automatycznie. Ważne jest, aby nanosić na kolumnę takie same ilości roztworów z dokładnością ± 0,5% zarówno w przypadku analizy roztworu wzorca, jak i roztworu badanej próbki, z wyjątkiem analizy roztworów z wzorcem wewnętrznym, oraz aby stosunek sodu do aminokwasu w roztworze badanej próbki był podobny jak w roztworze wzorcowym.

Należy stwierdzić, że częstość przeprowadzania kalibracji zależy od stabilności odczynnika ninhydrynowego i od całego systemu analitycznego. Wzorzec lub próbka są wymywane buforem cytrynianowym (3.24) tak, aby powierzchnia piku standardu odpowiadała 30 - 200% powierzchni piku badanej próbki aminokwasów.

Analiza chromatograficzna aminokwasów różni się nieco zależnie od typu stosowanego analizatora i żywicy. Wybrany system musi mieć zdolność rozdziału każdego aminokwasu od siebie oraz od innych substancji dających z ninhydryną barwne reakcje. W badanym zakresie stosowany system chromatograficzny powinien dawać liniową odpowiedź na zmiany ilości aminokwasów dozowanych na kolumnę.

W czasie analizy chromatograficznej należy sprawdzać, aby stosunki dolina : wysokość piku przy badaniu równomolowych roztworów (oznaczanych aminokwasów) odpowiadały podanym poniżej. Równomolowy roztwór musi zawierać co najmniej 30% maksymalnej zawartości każdego aminokwasu, który można prawidłowo oznaczyć z użyciem danego analizatora aminokwasów (4.9).

Dla rozdzielenia treoniny od seryny stosunek dolina : wysokość piku niższego z pokrywających się aminokwasów nie powinien przekraczać 2:10 (jeżeli tylko cystyna (cysteina), metionina, treonina i lizyna są oznaczane, niepełne rozdzielenie sprzężonych pików będzie ujemnie wpływało na oznaczenie). Dla wszystkich innych aminokwasów rozdział musi być lepszy niż 1:10.

System musi zapewniać rozdział lizyny od artefaktów lizyny i od ornityny.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Powierzchnia pików próbki i wzorca jest mierzona dla każdego pojedynczego aminokwasu i zawartość, w g aminokwasu na kg próbki, jest obliczana:

A x E x MW x F

--------------- = g aminokwasu na kg próbki.

B x W x 1.000

Jeżeli stosowany jest wzorzec wewnętrzny, wyrażenie mnożymy przez D/C.

A -   powierzchnia piku hydrolizatu lub ekstraktu,

B -   powierzchnia piku wzorcowego roztworu kalibracyjnego,

C -   powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w hydrolizacie lub ekstrakcie,

D -   powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w roztworze wzorcowym kalibracyjnym,

MW - masa cząsteczkowa oznaczanego aminokwasu,

E -   stężenie wzorca w µmol/ml,

W -   masa próbki (g) (przeliczyć na masę oryginalnej próbki w przypadku odtłuszczania lub podsuszania),

F -   całkowita ilość ml hydrolizatu (5.3.4) lub ilość ml hydrolizatu obliczona przy uwzględnieniu rozcieńczenia ekstraktu.

Cystyna i cysteina są oznaczane jako kwas cysteinowy w hydrolizatach utlenionej próbki, lecz są przeliczane na cystynę (C₆H₁₂N₂O₄S₂, MW 240,30) przez zastosowanie MW 120,15 (= 0,5 x 240,30).

Metionina jest oznaczana jako sulfon metioniny w hydrolizatach utlenionej próbki, ale przeliczana na metioninę przez zastosowanie MW metioniny: 149,21.

Dodana wolna metionina jest oznaczana po ekstrakcji jako metionina, dla obliczeń stosowana jest taka sama masa cząsteczkowa MW.

Całkowita objętość rozcieńczenia ekstraktów (F) w przypadku oznaczania zawartości wolnych aminokwasów (5.2) jest obliczana następująco:

            (10 ml + 5 ml)    V ml

F = 100 ml x ------------- x -----

                 10 ml      10 ml

V -   objętość końcowego ekstraktu.

7. SPRAWDZENIE METODY

Prawidłowe stosowanie metody należy weryfikować poprzez wykonywanie powtarzalnych oznaczeń certyfikowanych materiałów odwoławczych, o ile takie są dostępne.

Zalecana jest także kalibracja z zastosowaniem certyfikowanych roztworów wzorcowych aminokwasów.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Z powodu różnic pomiędzy analizatorami aminokwasów podawane tu końcowe stężenia wzorcowych roztworów kalibracyjnych aminokwasów (zgodnie z (3.27.4) i (3.27.5)) i hydrolizatu (zgodnie z (5.3.4)) należy traktować jako przykładowe.

Zakres liniowej odpowiedzi aparatu powinien zostać sprawdzony dla wszystkich aminokwasów.

Wzorcowy roztwór jest rozcieńczany buforem cytrynianowym tak, aby otrzymać pik o średniej powierzchni.

8.2. Jeżeli do analizy aminokwasów wykorzystywany jest wysokosprawny chromatograf cieczowy HPLC, należy zoptymalizować warunki doświadczalne analizy zgodnie z zaleceniami producenta.

8.3. Przy stosowaniu tej metody do pasz zawierających więcej niż 1% chlorków (koncentraty, mieszanki mineralne, pasze uzupełniające) wyniki oznaczania metioniny mogą być zaniżone i należy stosować specjalne postępowanie.

3.2. OZNACZANIE TRYPTOFANU

1. CEL I ZAKRES

Metoda dotyczy oznaczania ogólnego i wolnego tryptofanu w materiałach paszowych bez wyróżnienia form D i L.

2. ZASADA METODY

Dla oznaczania całkowitego tryptofanu próbka jest hydrolizowana w środowisku zasadowym nasyconego roztworu wodorotlenku baru i ogrzewana do temperatury 110°C przez 20 godzin. Po hydrolizie dodany jest wzorzec wewnętrzny.

Dla oznaczania wolnego tryptofanu próbka jest ekstrahowana w słabym kwasie w obecności wzorca wewnętrznego.

Tryptofan i wzorzec wewnętrzny w hydrolizacie lub w ekstrakcie jest oznaczony metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub wodę o porównywalnej jakości (przewodnictwo < 10 µS/cm).

3.2. Substancja wzorcowa: tryptofan (czystość ł 99%) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu

3.3. Standard wewnętrzny: a-metylo-tryptotan (czystość / zawartość 99%) suszony pod próżnią nad pięciotlenkiem fosforu

3.4. Wodorotlenek baru, oktahydrat (Należy uważać, aby nie wystawiać oktahydratu wodorotlenku baru na nadmierne działanie powietrza dla uniknięcia tworzenia się węglanu baru BaCO₃, który mógłby utrudniać oznaczenie. Z czasem wodorotlenek baru jest coraz trudniejszy do rozpuszczenia. W wyniku uzyskujemy nieklarowne roztwory do analizy HPLC, które mogą być przyczyną zaniżania wyników oznaczania tryptofanu.)

3.5. Wodorotlenek sodu

3.6. Kwas ortofosforowy, w = 85%

3.7. Kwas chlorowodorowy, d = 1,19 g/ml

3.8. Metanol, czystość HPLC

3.9. Eter naftowy, temperatura wrzenia 40 - 60°C

3.10. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l:

Rozpuścić 40,0 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić wodą (3.1) do 1l.

3.11. Kwas chlorowodorowy, c = 6 mol/l:

Odmierzyć 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić wodą do 1l.

3.12. Kwas chlorowodorowy, c = 1 mol/l:

Odmierzyć 82 ml HCl (3.7) i uzupełnić wodą do 1l.

3.13. Kwas chlorowodorowy, c = 0,1 mol/l:

Odmierzyć 8,2 ml HCl (3.7) i uzupełnić wodą do 1l.

3.14. Kwas ortofosforowy, c = 0,5 mol/l:

Odmierzyć 34 ml kwasu ortofosforowego (3.14) i dopełnić wodą (3.1) do 1l.

3.15. Stężony roztwór tryptofanu (3.2), c = 2,50 µmol/ml:

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2553 g tryptofanu (3.2) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do kreski kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze -18°C nie dłużej niż cztery tygodnie.

3.16. Stężony roztwór wzorca wewnętrznego, c = 2,50 µmol/ml

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2728 g a-metylo-tryptofanu (3.3) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do kreski kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18°C nie dłużej niż cztery tygodnie.

3.17. Kalibracyjny roztwór wzorcowy tryptofanu i wzorca wewnętrznego

Odmierzyć 2,00 ml stężonego roztworu tryptofanu (3.15) i 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (a-metylo-tryptofan) (3.16). Rozcieńczyć wodą (3.1) i metanolem (3.8) w przybliżeniu do tej samej objętości i tego samego stężenia metanolu (10 - 30%) w końcowym hydrolizacie. Roztwór należy przygotować tuż przed użyciem. Chronić przed bezpośrednim działaniem światła podczas przygotowywania.

3.18. Kwas octowy

3.19. 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanol

3.20. Etanoloamina > 98%

3.21. Roztwór 1 g 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w 100 ml metanolu (3.8)

3.22. Faza ruchoma do HCLP: 3,00 g kwasu octowego (3.18) + 900 ml wody (3.1) + 50 ml roztworu (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w metanolu (3.8) (1 g/100 ml). Doprowadzić pH do 5, stosując etanoloaminę (3.20). Uzupełnić wodą (3.1) do 1.000 ml.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Wyposażenie HPLC z detektorem spektrofluorometrycznym

4.2. Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm x 4 mm, C₁₈, wypełnienie 3 µm lub równoważne

4.3. Pehametr

4.4. Kolby propylenowe o pojemności 125 ml, z szeroką szyjką i nakrętką

4.5. Sączek membranowy, 0,45 µm

4.6. Autoklaw, 110 (±2)°C, 1,4 (±0,1) bar

4.7. Wytrząsacz mechaniczny lub mieszadło magnetyczne

4.8. Mieszadło Vortex

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbek

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez sito o otworach 0,5 mm. Próbki o dużej wilgotności należy wysuszyć w temperaturze nieprzekraczającej 50°C lub przez wymrażanie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu należy ekstrahować eterem naftowym (3.9) przed rozdrobnieniem.

5.2. Oznaczanie wolnego tryptofanu (ekstrakt)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, odpowiednią ilość (1-5 g) przygotowanej próbki (5.1) do kolby stożkowej. Dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego, c = 0,1 mol/l (3.13) i 5,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16). Wstrząsać lub mieszać przez 60 minut przy użyciu wstrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić do oddzielenia się osadu i przenieść pipetą 10,0 ml roztworu znad osadu do zlewki. Dodać 5 ml kwasu ortofosforowego, c = 0,5 mol/l (3.14). Doprowadzić do pH 3,0 za pomocą wodorotlenku sodu, c = 1,0 mol/l (3.10). Dodać odpowiednią ilość metanolu (3.8) do uzyskania stężenia 10 do 30% metanolu w końcowym roztworze. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej objętości i rozcieńczyć wodą do objętości właściwej dla chromatografii (w przybliżeniu taka sama objętość jak kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17)).

Przesączyć kilka ml roztworu przez sączek membranowy 0,45 µm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC.

Przeprowadzić chromatografię zgodnie z (5.4).

Chronić roztwór wzorcowy i ekstrakty przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli niemożliwe jest dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty należy przechowywać w temperaturze 5°C nie dłużej niż przez trzy dni.

5.3. Oznaczanie całkowitego tryptofanu (hydrolizat)

Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g przygotowanej próbki (5.1) do kolby propylenowej (4.4). Próbka analityczna powinna zawierać około 10 mg azotu. Dodać 8,4 g oktahydratu wodorotlenku baru (3.4) i 10 ml wody. Mieszać przy użyciu mieszadła Vortex (4.8) lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić osłonięty teflonem magnes w mieszaninie. Spłukać ściany naczynia przy użyciu 4 ml wody. Nałożyć nakrętkę i zamknąć luźno naczynie. Przenieść do autoklawu (4.6) i utrzymywać w stanie wrzącej wody i pary przez 30 - 60 minut. Zamknąć autoklaw i autoklawować przy temperaturze 110°C (±2)°C przez 20 godzin.

Przed otwarciem autoklawu obniżyć temperaturę nieco poniżej 100°C. W celu uniknięcia krystalizacji Ba(OH)₂ x 8H₂O dodać do gorącej mieszaniny 30 ml wody o temperaturze pokojowej. Łagodnie wstrząsać lub mieszać. Dodać 2 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (a-metylo-tryptofan) (3.16). Studzić naczynia na łaźni wodnej lub lodowej przez 15 minut.

Następnie dodać 5 ml kwasu ortofosforowego, c = 0,5 mol/l (3.14). Utrzymując naczynie w zimnej łaźni, zobojętnić za pomocą HCl, c = 6 mol/l (3.11), mieszając, i doprowadzić do pH 3,0 za pomocą HCl, c = 1 mol/l (3.12). Dodać odpowiednią ilość metanolu dla uzyskania stężenia metanolu między 10 a 30% w końcowym roztworze. Przenieść do kolby miarowej odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do określonej objętości, właściwej do chromatografii (na przykład do 100 ml).

Dodatek metanolu nie powinien powodować wytrącania.

Przesączyć kilka ml roztworu przez sączek membranowy 0,45 µm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC.

Przeprowadzić chromatografię zgodnie z opisem w (5.4).

Chronić roztwór wzorcowy i ekstrakty przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli niemożliwe jest dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty należy przechowywać w temperaturze 5°C nie dłużej niż przez trzy dni.

5.4. Analiza HPLC

Poniższe parametry izokratycznej elucji podano jako przykładowe; inne parametry mogą być zastosowane pod warunkiem, że ich zastosowanie doprowadzi do otrzymania równoważnych wyników zgodnie z (8.1) i (8.2):

Kolumna do chromatografii             125 mm x 4 mm, C₁₈,

cieczowej (4.2):                      wypełnienie 3 µm lub podobne

Temperatura kolumny:                  temperatura pokojowa

Faza ruchoma (3.22):                  3,00 g kwasu octowego (3.18) + 900 ml wody

                                      (3.1)+ 500 ml roztworu (3.21) 1,1,1-trichloro-2-  metylo-2-propanolu (3.19) w metanolu (3.8) (1   g/100 ml). Doprowadzić do pH 5,00 przy użyciu   etanoloaminy (3.20). Dopełnić do 1.000 ml wodą   (3.1).

Przepływ:                             1 ml/min

Czas analizy chromatograficznej:      około 34 minuty

Długość fali przy detekcji:

-   wzbudzenie                        310 nm

-   emisja                            419 nm

Dozowana objętość                     20 µl

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

A x B x C x D x E x MW

----------------------- = g tryptofanu na 100 g próbki,

F x G x H x 10.000 x W

gdzie:

A -   pole piku wzorca wewnętrznego, roztwór wzorcowy kalibracyjny (3.17);

B -   pole piku tryptofanu, ekstrakt (5.2) lub hydrolizat (5.3);

C -   objętość w ml (2 ml) stężonego roztworu tryptofanu (3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (3.17);

D -   stężenie w µmol/ml (= 2,50) stężonego roztworu tryptofanu (3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (3.17);

E -   objętość w ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16) dodanego przy ekstrakcji (5.2) (= 5,00 ml) lub do hydrolizatu (5.3) (= 2,00 ml);

F -   pole piku wzorca wewnętrznego, ekstrakt (5.2) lub hydrolizat (5.3);

G -   pole piku tryptofanu, roztwór wzorcowy kalibracyjny (3.17);

H -   objętość, w ml (= 2,00 ml), stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16) dodanego do roztworu wzorcowego kalibracyjnego (3.17);

W -   naważka próbki w g (odniesiona do masy wyjściowej, jeśli podsuszano lub odtłuszczano);

MW - ciężar cząsteczkowy tryptofanu (= 204,23).

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać 10% w odniesieniu do powyższego wyniku.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Następujące szczególne warunki chromatograficzne mogą dać lepszy rozdział tryptofanu i a-metylo-tryptofanu.

Izokratyczna elucja po gradientowym czyszczeniu kolumny:

 

Kolumna do chromatografii cieczowej:   125 mm x 4 mm, faza odwrócona C18

wypełnienie 5 µm lub podobne

Temperatura kolumny:                   32°C

Faza ruchoma:                          A: 0,01 mol/l KH2PO4/Metanol, 95 + 5 (V+V).

B: Metanol

0 min     100% A     0%B

15 min    100% A     0%B

17 min    60% A      40%B

19 min    60% A      40%B

21 min    100% A     0%B

33 min    100% A     0%B

Przepływ:                              1,2 ml/min

Czas analizy chromatograficznej:       około 33 minuty

 

8.2. Analiza chromatograficzna może się różnić w zależności od typu aparatu HPLC i wypełnienia kolumny. Wybrany system powinien umożliwić uzyskanie linii podstawy pomiędzy pikami tryptofanu i wzorca wewnętrznego. Ponadto jest ważne, aby produkty degradacji zostały dobrze oddzielone od tryptofanu i wzorca wewnętrznego. Hydrolizaty bez wzorca wewnętrznego powinny być poddane analizie chromatograficznej w celu określenia linii podstawy i miejsca elucji zanieczyszczeń. Ważne jest, aby czas analizy był wystarczająco długi dla elucji wszystkich produktów degradacji, ponieważ ostatnie piki na chromatogramie mogą zakłócać kolejną analizę. W zakresie badanych stężeń układ chromatograficzny powinien zapewniać liniową odpowiedź. Liniową odpowiedź należy mierzyć przy stałym (normalnym) stężeniu wzorca wewnętrznego i zmieniających się stężeniach tryptofanu. Ważne jest, aby wielkość pików tryptofanu i wzorca wewnętrznego zawierały się w liniowym zakresie układu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Jeżeli piki tryptofanu i/lub wzorca wewnętrznego są zbyt małe lub zbyt duże, analiza powinna być powtórzona, przy zmianie wielkości odważki i/lub objętości roztworu końcowego.

8.3. Wodorotlenek baru

Z czasem wodorotlenek baru jest coraz trudniejszy do rozpuszczenia. W wyniku uzyskujemy nieklarowne roztwory do analizy HPLC, które mogą być przyczyną zaniżania wyników oznaczania tryptofanu.

3.3. OZNACZANIE DOSTĘPNEJ LIZYNY

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania dostępnej lizyny w paszach zawierających białka zwierzęce lub roślinne.

Dostępna lizyna, mająca wolną grupę epsilon-aminową, to ilość lizyny odpowiadająca różnicy między lizyną całkowitą a lizyną niedostępną, oznaczona w warunkach podanych w niniejszej metodzie.

Dostępną lizynę oznacza się na podstawie możliwości łączenia się wolnej grupy epsilon-aminowej z 2,4-dinitrofluorobenzenem. W porównaniu z biologiczną metodą oznaczania, w przypadku stosowania tej metody można otrzymać zawyżoną ilość lizyny, dlatego należy zachować ostrożność przy interpretacji wyników.

Dostępną lizynę wyraża się w procentach masy analizowanego produktu.

2. ZASADA METODY

Hydroliza kwasem chlorowodorowym odważki analitycznej badanego materiału, następnie oddzielenie całkowitej lizyny na kolumnie chromatograficznej i oznaczanie spektrometryczne przy 570 nm.

Reakcja drugiej odważki analitycznej z etanolowym roztworem 2,4-dinitrofluorobenzenu w środowisku zasadowym, oczyszczenie, hydroliza kwasem chlorowodorowym, oddzielenie niedostępnej lizyny na kolumnie chromatograficznej i oznaczanie spektrometryczne przy 570 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Eter dietylowy, wolny od nadtlenków

3.2. Węglan sodu, roztwór o stężeniu 80 g/l

3.3. 2,4-dinitrofluorobenzen (DNFB), roztwór etanolowy. Rozpuścić 0,15 ml DNFB w 12 ml 95% (V/V) alkoholu etylowego. Roztwór przygotować tuż przed użyciem,

3.4. Kwas chlorowodorowy, około 6 mol/l. Zmieszać 1 objętość kwasu chlorowodorowego (d = 1,19 g/ml) z l objętością wody.

3.5. Cytrynian sodu, roztwór buforowy, pH około 2,2

Kolejno rozpuszczać w wodzie:

-   21 g jednowodnego kwasu cytrynowego;

-   8 g wodorotlenku sodu;

-   16 ml kwasu chlorowodorowego (d = 1,19 g/ml);

-   0,1 ml kwasu oktanowego (kaprylowego);

-   20 ml tiodiglikolu;

-   3 ml 30% (F/F) wodnego roztworu eteru dodecylo,- polioksyetylenowego z około 23 cząsteczkami oksyetylenu³⁾.

Dopełnić wodą do 1.000 ml.

3.6. Cytrynian sodu, roztwór buforowy, pH 5,28

Kolejno rozpuszczać w wodzie:

-   24,5 g jednowodnego kwasu cytrynowego;

-   14 g wodorotlenku sodu;

-   6,8 ml kwasu chlorowodorowego (d = 1,19 g/ml);

-   0,1 ml kwasu oktanowego (kaprylowy);

-   3 ml 30% (V/V) wodnego roztworu eteru dodecylo,- polioksyetylenowego z około 23 cząsteczkami oksyetylenu⁴⁾

Dopełnić wodą do 1.000 ml. Doprowadzić pH do 5,28 ± 0,02 za pomocą kwasu chlorowodorowego (d = 1,19 g/ml) lub 50% (m/m) roztworem wodorotlenku sodu.

3.7. Odczynnik ninhydrynowy

3.7.1. Propionian sodu, roztwór buforowy, pH 5,5 ± 0,1

Rozpuścić 168 g wodorotlenku sodu w około 400 ml wody. Ostudzić, ciągle mieszając, dodać 498 ml kwasu propionowego.

Dopełnić wodą do 1.000 ml.

3.7.2. Przygotowanie odczynnika

Odczynnik ninhydrynowy przygotowywać w atmosferze azotu i bez dostępu światła. W 21 kolbie umieścić 11 wolnego od nadtlenków jednometylowego eteru glikolu etylenowego, 11 roztworu buforowego propionianu sodu (3.7.1) i 40 g ninhydryny. Wstrząsać do całkowitego rozpuszczenia, następnie dodać 1,33 g dihydratu chlorku cyny(II), (SnCl₂ x 2H₂O).

Wstrząsać do całkowitego rozpuszczenia.

Odczynnik jest stabilny przez 1 miesiąc, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4°C, w atmosferze i przy niewielkim nadciśnieniu azotu oraz bez dostępu światła.

Jeśli wytrąca się osad SnCl₂, zastąpić go 7,5 ml roztworu chlorku tytanu(III) o stężeniu 150 g/l lub 1,5 g hydrindantiny na litr odczynnika.

3.8. Lizyna, roztwór wzorcowy odpowiadający 1 mmolowi lizyny właściwej na litr

Rozpuścić 182,5 mg jednochlorowodorku lizyny w 100 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 0,1 mol/l. Wziąć dokładnie 10 ml tego roztworu i dopełnić cytrynianowym roztworem buforowym o pH 2,2 (3.5) do 100 ml. 1 ml tego roztworu zawiera 1 µmol lizyny właściwej.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Młynek, o następującej charakterystyce:

a)  wykonany z materiału niepochłaniającego wilgoci;

b)  łatwy do czyszczenia i mający jak najmniej martwych przestrzeni;

c)  umożliwiający szybkie i homogeniczne mielenie, niepowodujący nadmiernego ogrzania i zabezpieczający, najlepiej jak to możliwe, przed kontaktem z powietrzem;

d)  z regulacją umożliwiającą otrzymanie cząstek o rozmiarach opisanych w (5.1).

4.2. Kolby, o pojemności 250 ml i 1.000 ml, płaskodenne, z wąską szyją, ze stożkowym szlifem i chłodnicami zwrotnymi pasującymi do kolb

4.3. Tygiel, ze szklanym spiekiem o rozmiarze P-16 (rozmiar porów od 10 do 16 µm)

4.4. Łaźnia olejowa, zdolna do utrzymania temperatury, która zapewnia skraplanie (120 do 130°C)

4.5. Obrotowy odparowywacz próżniowy

4.6. Aparat do automatycznej analizy aminokwasów lub, jeśli taki jest niedostępny, manualny układ chromatograficzny o następującym składzie:

a)   kolumna chromatograficzna o długości około 250 mm i wewnętrznej średnicy 6 mm, termostatowana w temperaturze 55°C za pomocą płaszcza wodnego i termostatowej łaźni cyrkulacyjnej, napełniona do wysokości 200 mm kationitową jonowymienną żywicą, mocno kwaśną, z 8% usieciowaniem, z sulfonowymi grupami funkcyjnymi, wielkość cząsteczek -13 ±2 µm⁴⁾;

b)   mała pompa tłokowa o wydajności 50 ml/h;

c)   kolektor frakcji;

d)   wrząca łaźnia wodna;

e)   spektrometr ustawiony na 570 nm, z kuwetą pomiarową o długości 10 mm.

4.7. Pipety skalowane, o pojemności 1; 5 i 10 ml

4.8. Kolby pomiarowe, o pojemności 10; 20 i 100 ml

4.9. Waga analityczna

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki do badań

Rozdrobnić od 5 do 10 g próbki analitycznej tak, aby całkowicie przeszła przez sito o rozmiarze oczek 315 µm.

5.2. Odważki analityczne

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, i umieścić odpowiednio w dwóch kolbach (4.2) dwie odważki analityczne, każda odpowiadająca około 100 mg białka ogólnego.

5.3. Całkowita lizyna

5.3.1. Hydroliza z kwasem chlorowodorowym

Do kolby o pojemności 1.000 ml z odważką (odważyć, z dokładnością do 1 mg, i umieścić odpowiednio w dwóch kolbach (4.2) dwie odważki analityczne, każda odpowiadająca około 100 mg białka ogólnego) wprowadzić 500 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.4), przymocować chłodnicę zwrotną i kolby umieścić w łaźni olejowej (4.4), wcześniej ogrzanej od temperatury 120 do 130°C. Zawartość utrzymywać przy łagodnym wrzeniu przez 24 h, następnie ostudzić i przesączyć przez tygiel (4.3). Odparować filtrat w temperaturze nie wyższej niż 40°C, używając do tego celu obrotowego odparowywacza próżniowego (4.5). Do pozostałości dodać wody i odparować. Powtarzać czynność do momentu usunięcia nadmiaru kwasu chlorowodorowego; zazwyczaj wystarczają cztery przemycia 30 ml wody.

Pozostałość rozpuścić w roztworze buforowym cytrynianu sodu o pH 2,2 (3.5) i przenieść ilościowo do 100 ml kolby pomiarowej (4.8). Dopełnić do kreski roztworem buforowym cytrynianu sodu o pH 2,2 (3.5). Przesączyć zawartość przez sączek karbowany.

5.3.2. Końcowe przygotowanie kolumny i nanoszenie hydrolizatu

Podłączyć pompę urządzenia (4.6) do zbiornika zawierającego roztwór buforowy cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6). Następnie uregulować przepływ na poziomie 50 ml/h. Podłączyć pompę do kolumny z żywicą, uprzednio podgrzanej do temperatury 55°C, a następnie przez kolumnę przepuszczać roztwór buforowy przez 20 min w celu ustalenia równowagi jonowymiennej. Odłączyć pompę. Usunąć większość cieczy znad żywicy, uważając, aby powierzchnia żywicy nie pozostała sucha.

Odmierzyć pipetą (4.7) 0,5 ml hydrolizatu (lub 1 ml w przypadku wykorzystania systemu ręcznego) i nanieść na kolumnę, następnie wtłoczyć w żywicę za pomocą azotu o niewielkim ciśnieniu. Przemyć ścianki kolumny 0,5 ml roztworu buforowego cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6) i wtłoczyć w żywicę. Napełnić kolumnę do pełna roztworem buforowym cytrynianu sodu (3.6) i podłączyć pompę.

5.3.3. Oznaczanie

5.3.3.1. System automatyczny

Włączyć analizator. Wykalibrować aparaturę, postępując w sposób opisany w (5.3.2), używając 0,25 µmol lizyny [0,25 ml wzorcowego roztworu lizyny (3.8)] lub ilość podaną w instrukcji producenta.

5.3.3.2. System ręczny

5.3.3.2.1. Lokalizacja lizyny

Frakcje eluatu zawierające lizynę określić za pomocą roztworu lizyny o znanym stężeniu, np. 1 µmol/ml roztworu (3.8). W tym celu odrzucić pierwsze 25 do 30 ml eluatu, a następnie zbierać 1 ml frakcje do probówek aż do otrzymania 50. frakcji, licząc od początku wymywania. Dodać do każdej frakcji, między 30. a 50. frakcją, 1 ml odczynnika ninhydrynowego (3.7). Zamieszać, umieścić we wrzącej łaźni wodnej i pozostawić na 15 min. Pozostawić do ostudzenia. Rozcieńczyć, dodając 10 ml roztworu buforowego cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6). Zamieszać i zmierzyć absorbancję roztworu przy 570 nm na spektrometrze, używając jako roztworu odniesienia roztworu buforowego cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6).

Tylko informacyjnie: w warunkach opisanych powyżej lizyna zazwyczaj eluuje między 39. a 45. frakcją.

5.3.3.2.2. Oznaczanie

Jeśli lizyna została wymyta między 39. a 45. frakcją, odrzucić pierwsze 38 ml eluatu, zebrać i połączyć frakcje (od 39. do 45.) odpowiadające pikowi lizyny i odparować za pomocą obrotowego odparowywacza próżniowego (4.5).

Po oddzieleniu frakcji zawierających lizynę przepuścić około 200 ml roztworu buforowego przez kolumnę w celu usunięcia wszystkich pozostałych, niepożądanych składników.

Pozostałość po odparowaniu rozpuścić w 5 ml roztworu buforowego cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6) i dodać 5 ml odczynnika ninhydrynowego (3.7). Wymieszać, przenieść do wrzącej łaźni wodnej i pozostawić na 15 min. Ostudzić. Rozcieńczyć mieszaninę roztworem buforowym cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6) tak, aby stężenie lizyny w badanym roztworze wyniosło około 0,02 µmol/ml (niech V₁ oznacza objętość badanego roztworu).

Zmierzyć absorbancję na spektrometrze, przy 570 nm, używając jako roztworu odniesienia mieszaniny jednej objętości roztworu buforowego cytrynianu sodu (3.6) i jednej objętości odczynnika ninhydrynowego (3.7), która została umieszczona na 15 min we wrzącej łaźni wodnej i rozcieńczona do objętości V₁ po ostudzeniu.

5.3.3.2.3. Kalibracja spektrometru

Odmierzyć dokładnie 5 ml wzorcowego roztworu lizyny (3.8). Dodać 5 ml odczynnika ninhydryny (3.7). Wymieszać, umieścić we wrzącej łaźni wodnej i pozostawić na 15 min. Ostudzić i rozcieńczyć do 100 ml roztworem buforowym cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6).

Zmierzyć absorbancję na spektrometrze w takich samych warunkach jak te podane w (5.3.3.2.2).

5.4. Niedostępna lizyna

5.4.1. Reakcja dinitrofenylowania

Do 250 ml kolby z odważką (odważyć, z dokładnością do 1 mg, i umieścić odpowiednio w dwóch kolbach (4.2) dwie odważki analityczne, każda odpowiadająca około 100 mg białka surowego) odmierzyć pipetą (4.7) 8 ml roztworu węglanu sodu (3.2). Pozostawić na około 10 min, wstrząsając od czasu do czasu. Następnie dodać roztwór DNFB (3.3), zakorkować kolbę, wstrząsnąć, upewnić się, że żadna cząstka nie pozostała na ścianach kolby i pozostawić mieszaninę na noc w temperaturze pokojowej i bez dostępu światła.

5.4.2. Oczyszczanie

Odparować zawartość kolby do sucha w temperaturze poniżej 40°C, używając obrotowego odparowywacza próżniowego (4.5). Dodać 75 ml eteru dietylowego (3.1) do kolby, zamieszać i pozostawić do rozdzielenia faz. Odlać większość eteru, uważając, aby nie odlać razem z nim cząstek stałych. Czynność powtórzyć dwa razy, za każdym razem używając 50 ml eteru. Odparować resztki eteru na obrotowym odparowywaczu próżniowym.

5.4.3. Hydroliza z kwasem chlorowodorowym

Przenieść ilościowo pozostałość do kolby o pojemności 150 ml za pomocą kwasu chlorowodorowego (3.4) i postępować w sposób opisany w (5.3.1). Pozostałość po wymyciu kwasu chlorowodorowego rozpuścić roztworem buforowym cytrynianu sodu o pH 2,2 (3.5) i przenieść ilościowo do 20 ml kolby pomiarowej (4.8) (lub do 10 ml w przypadku zastosowania systemu ręcznego).

5.4.4. Rozdzielanie hydrolizatu i oznaczanie

Postępować w sposób opisany w (5.3.2) i (5.3.3).

W przypadku zastosowania systemu ręcznego końcowe wskazanie spektrometru można odczytać po rozcieńczeniu roztworu lizyny z dodatkiem mieszaniny odczynników do objętości 20 ml, za pomocą roztworu buforowego cytrynianu sodu o pH 5,28 (3.6) (niech V₂ oznacza objętość roztworu analitycznego).

5.5. Liczba oznaczeń

Wykonać dwa oznaczania tej samej próbki badanej, stosując dwie różne pary odważek analitycznych.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

6.1. Sposób obliczania i wzór

6.1.1. Całkowita lizyna

6.1.1.1. Oznaczanie z zastosowaniem automatycznego analizatora

Całkowita lizyna w₁, wyrażona w procentach obliczonych masowo, jest równa:

0,365      S₁

-------- x ----,

m₁ x V₀     S₀

gdzie:

S₀ -  jest polem powierzchni piku odpowiadającego 0,25 µmol lizyny;

S₁ -  jest polem powierzchni piku całkowitej lizyny oznaczanej wg (5.3.3.1);

m₁ -  jest masą odważki analitycznej umieszczonej w pierwszej kolbie, w g;

V₀ -  jest objętością hydrolizatu naniesionego na kolumnę (zazwyczaj V₀ = 0,5 ml), w ml.

6.1.1.2. Oznaczanie z zastosowaniem systemu ręcznego

Całkowita lizyna wyrażona w procentach obliczonych masowo, jest równa:

V₁ x 0,073     A₁

----------- x ----,

m₁ x V₀       A₀

gdzie:

A₀ - jest absorbancją wzorcowego roztworu lizyny oznaczoną według (5.3.3.2.3);

A₁ - jest absorbancją oznaczoną według (5.3.3.2.2);

V₀- jest objętością hydrolizatu naniesionego na kolumnę (zazwyczaj V₀ = 1 ml), w ml;

V₁ - jest objętością roztworu badanego, w ml;

m₁ - jest masą odważki analitycznej umieszczonej w pierwszej kolbie, w g.

6.1.2. Niedostępna lizyna

6.1.2.1. Oznaczanie z zastosowaniem automatycznego analizatora

Niedostępna lizyna w₂, wyrażona w procentach obliczonych masowo, jest równa:

0,073     S₂

------- x ----,

m₂ x V₀     S₀

gdzie:

S₀ -  jest polem powierzchni piku odpowiadającego 0,25 µmol lizyny;

S₂ -  jest polem powierzchni piku odpowiadającego niedostępnej lizynie oznaczonej według (5.4.4);

m₂ -  jest masą odważki analitycznej umieszczonej w drugiej kolbie, w g;

V₀ -  jest objętością hydrolizatu naniesionego na kolumnę (zazwyczaj V₀ = 0,5 ml), w ml.

6.1.2.2. Oznaczanie z zastosowaniem systemu ręcznego

Niedostępna lizyna w₂, wyrażona w procentach obliczonych masowo, jest równa:

V₂ x 0,0073    A₂

----------- x ----,

m₂ x V₀       A₀

gdzie:

A₀ - jest absorbancją wzorcowego roztworu lizyny oznaczoną w (5.3.3.2.3);

A₂ - jest absorbancją oznaczoną w (5.4.4);

V₀ - jest objętością hydrolizatu naniesionego na kolumnę (zazwyczaj V₀ = 1 ml), w ml;

V₂ - jest objętością roztworu badanego (zazwyczaj V₂ = 20 ml), w ml;

m₂ - jest masą odważki analitycznej umieszczonej w drugiej kolbie, w g.

6.1.3. Dostępna lizyna

Dostępna lizyna w₃, wyrażona w procentach obliczonych masowo, jest równa:

w₁ - w₂,

gdzie:

w₁ -  jest całkowitą lizyną (6.1.1);

w₂ -  jest niedostępną lizyną (6.1.2);

Dostępną lizynę, wyrażoną w procentach lizyny całkowitej, oblicza się według wzoru:

(w₁ - w₂)

---------- x 100

  w₁

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych w tym samym czasie przez tego samego laboranta nie powinna przekraczać 10% średniej wartości otrzymanych wyników.

8. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań powinno zawierać informacje o zastosowanej metodzie i uzyskanych wynikach, jak również wszystkie szczegóły niewymienione w niniejszej metodzie lub traktowane jako opcjonalne, łącznie z wszelkimi okolicznościami, które mogły wpływać na wyniki.

Sprawozdanie powinno zawierać wszystkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próbki.

Rozdział 4

BADANIE SKŁADNIKÓW MINERALNYCH

4.1. OZNACZANIE WAPNIA

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania całkowitej zawartości wapnia w paszach.

2. ZASADA METODY

Próbka jest spopielana, popiół rozpuszczany w kwasie chlorowodorowym i wapń strącany jako szczawian wapnia. Osad jest rozpuszczany w kwasie siarkowym, a uwolniony kwas szczawiowy miareczkowany roztworem manganianu(VII) potasu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, d = 1,14 g/ml

3.2. Kwas azotowy, d = 1,40 g/ml

3.3. Kwas siarkowy, d = 1,13 g/ml

3.4. Amoniak, d = 0,98 g/ml

3.5. Zimny nasycony roztwór szczawianu amonu

3.6. Kwas cytrynowy, 30% roztwór (m/V)

3.7. Chlorek amonu, 5% roztwór (m/V)

3.8. Roztwór zieleni bromokrezolowej, 0,04% (m/V)

3.9. Roztwór manganianu(VII) potasu 0,1 N

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Elektryczny piec do spalań z termostatem i możliwością cyrkulacji powietrza

4.2. Tygle do spalań platynowe, kwarcowe lub porcelanowe

4.3. Szklane tygle ze spiekiem o porowatości G4

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć około 5 g próbki (lub więcej, jeśli to konieczne), z dokładnością do 1 mg, spopielić w temperaturze 550°C i przenieść popiół do 250 ml zlewki.

Dodać 40 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), 60 ml wody i kilka kropli kwasu azotowego (3.2). Doprowadzić do wrzenia i gotować przez 30 minut. Schłodzić i przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Spłukać zlewkę, przenieść popłuczyny do kolby i uzupełnić kolbę do kreski wodą, wymieszać i przesączyć.

Za pomocą pipety przenieść do zlewki o pojemności 250 ml część roztworu zawierającą od 10 do 40 mg wapnia zgodnie z przewidywaną zawartością. Dodać 1 ml roztworu kwasu cytrynowego (3.6) i 5 ml roztworu chlorku amonu (3.7). Uzupełnić wodą do około 100 ml. Doprowadzić do wrzenia, dodać 8 do 10 kropli zieleni bromokrezolowej (3.8) i 30 ml gorącego roztworu szczawianu amonu (3.5). Jeśli pojawi się osad, należy go rozpuścić, dodając kilka kropli kwasu chlorowodorowego (3.1). Zobojętniać bardzo wolno amoniakiem (3.4), ciągle mieszając, do osiągnięcia pH 4,4 do 4,6 (tj. gdy wskaźnik zmieni barwę). Umieścić zlewkę we wrzącej łaźni wodnej i utrzymywać przez 30 minut celem strącenia osadu. Usunąć zlewkę z łaźni wodnej. Pozostawić na 1 godzinę celem odstania osadu i przesączyć przez tygiel filtracyjny G4 (4.3).

Przemywać wodą zlewkę i tygiel z osadem do całkowitego usunięcia nadmiaru szczawianu amonowego (nieobecność chlorków w roztworze po przemyciu świadczy o tym, że osad został zupełnie przemyty).

Rozpuścić osad zebrany na tyglu filtracyjnym w 50 ml gorącego kwasu siarkowego (3.3). Spłukać tygiel gorącą wodą i rozcieńczyć przesącz do około 100 ml. Podgrzać do temperatury 70 - 80°C i miareczkować, kroplami, roztworem manganianu(VII) potasu (3.9) do pojawienia się różowego zabarwienia utrzymującego się co najmniej przez minutę.

6. OBLICZENIE WYNIKÓW

1 ml 0,1 N manganianu(VII) potasu odpowiada 2,004 mg wapnia. Wynik wyrazić w procentach wagowych.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Przy małych zawartościach wapnia postępować następująco. Osad szczawianu wapnia przesączyć przez bibułę bezpopiołową. Po przemyciu wysuszyć sączek z zawartością i spopielić w platynowym tyglu w temperaturze 550°C. Rozpuścić pozostałość w kilku kroplach kwasu siarkowego (3.3), odparować do sucha, wstawić ponownie do pieca o temperaturze 550°C i zważyć. Jeśli W jest masą otrzymanego siarczanu wapnia, zawartość wapnia w części roztworu próbki pobranego do analizy wynosi W x 0,2944.

7.2. Jeśli próbka składa się jedynie z substancji mineralnych, należy ją rozpuścić w kwasie chlorowodorowym bez uprzedniego spopielania. W przypadkach takich produktów jak fosforan(V) glinu i wapnia, który trudno rozpuszcza się w kwasie, należy przed rozpuszczeniem stopić je w środowisku alkalicznym. W tym celu w tyglu platynowym umieścić odważkę próbki i dokładnie wymieszać w stosunku 1:5 z mieszaniną zawierającą równoważne ilości węglanu potasu i węglanu sodu. Delikatnie ogrzewać do całkowitego stopienia. Schłodzić i rozpuścić w kwasie chlorowodorowym.

7.3. Gdy próbka zawiera dużo magnezu, należy powtórnie strącić szczawian wapnia.

4.2. OZNACZANIE SODU

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości sodu w paszach.

2. ZASADA METODY

Próbka jest spopielana i popiół rozpuszczany w kwasie chlorowodorowym. Zawartość sodu w roztworze jest oznaczana metodą fotometrii płomieniowej w obecności chlorku cezu i azotanu glinu. Dodatek tych substancji w dużym stopniu eliminuje interferencje przeszkadzających pierwiastków.

3. ODCZYNNIKI l ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, d = 1,12 g/ml

3.2. Chlorek cezu

3.3. Azotan glinu Al(NO₃)₃ x 9H₂O

3.4. Chlorek sodu, bezwodny

3.5. Roztwór obciążający. Rozpuścić w wodzie 50 g chlorku cezu (3.2) i 250 g azotanu glinu (3.3), uzupełnić wodą do 1 litra i wymieszać. Przechowywać w plastikowej butelce.

3.6. Roztwór podstawowy sodu: rozpuścić 2,542 g chlorku sodu (3.4) i 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), uzupełnić wodą do 1 litra i wymieszać. Przechowywać w plastikowej butelce. 1 ml roztworu zawiera 1,00 mg sodu.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Tygle do spalań platynowe, kwarcowe lub porcelanowe, zalecane z przykrywkami

4.2. Elektryczny piec do spalań z termostatem

4.3. Fotometr płomieniowy

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Analiza próbki

Odważyć ponad 10 g próbki, z dokładnością do 10 mg, umieścić w tyglu (4.1) i spopielać 3 godziny w temperaturze 450°C. Nie dopuścić do zapalenia się próbki. Po schłodzeniu przenieść popiół ilościowo do 500 ml kolby miarowej za pomocą 250 - 300 ml wody, a następnie dodać 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.1). Po całkowitym uwolnieniu ditlenku węgla roztwór ogrzać i utrzymywać 2 godziny w temperaturze 90°C, od czasu do czasu mieszając. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej uzupełnić kolbę do kreski wodą, wstrząsnąć i przesączyć. W kolbie miarowej o pojemności 100 ml umieścić taką ilość przesączu, która będzie zawierała nie więcej niż 1,0 mg sodu, dodać 10 ml roztworu obciążającego (3.5), uzupełnić do kreski wodą i wymieszać. W przypadku wyższej zawartości sodu rozcieńczyć analizowany roztwór przed dodaniem roztworu obciążającego.

Tabela 3. Przykład dla próbki o masie 10 g

 

Zawartość sodu w próbce (% Na)	Rozcieńczenie	Pobrana do oznaczania część roztworu, w ml	Współczynnik rozcieńczenia 1/k
do 0,1	-	50	10
0,1 do 0,5	-	10	50
0,5 do 1,0	-	5	100
1,0 do 5,0	1 : 10	10	500
5,0 do 10,0	1 : 10	5	1.000
10,0 do 20,0	1 : 20	5	2.000

 

Dokonać pomiaru fotometrycznego przy długości fali 589 nm. Obliczyć wynik, korzystając z krzywej kalibracyjnej.

5.2. Krzywa kalibracyjna

Odmierzyć dokładnie 10 ml roztworu wzorcowego (3.6) i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Uzupełnić kolbę do kreski wodą i wymieszać. W kolbach miarowych o pojemności 100 ml umieścić kolejno 5, 10, 15, 20 i 25 ml roztworu, co odpowiada 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 mg sodu. Dołączyć jeszcze jedną kolbę niezawierającą roztworu podstawowego. Dodać 10 ml buforu spektralnego (3.5) do każdej kolby, uzupełnić wodą do kreski i wymieszać. Przeprowadzić oznaczenie tak jak w (5.1). Krzywa kalibracyjna ma przebieg liniowy w zakresie do 1 mg Na w 100 ml roztworu.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość sodu w procentach wagowych X (%) według wzoru:

        A * R

X(%) = --------

       m * 10

w którym:

A -   ilość sodu odczytana z krzywej kalibracyjnej, w mg,

R -   współczynnik rozcieńczenia 1/k, wskazujący, jaką część roztworu próbki k pobrano do oznaczeń w końcowym roztworze pomiarowym,

m -   masa próbki, w g

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Produkty zawierające ponad 4% sodu można spopielać 2 godziny pod przykryciem. Po ochłodzeniu dodać wody, utworzyć zawiesinę za pomocą drucika platynowego, wysuszyć i ponownie spopielać przez 2 godziny w tyglu z przykrywką.

7.2. Próbkę zawierającą wyłącznie substancje mineralne należy rozpuścić bez spopielania.

4.3. OZNACZANIE POTASU

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości potasu w paszach.

2. ZASADA METODY

Próbka jest spopielana, a popiół rozpuszczany w kwasie chlorowodorowym. Zawartość potasu w roztworze jest oznaczana metodą fotometrii płomieniowej w obecności chlorku cezu i azotanu glinu. Dodatek tych substancji w dużym stopniu eliminuje interferencje przeszkadzających pierwiastków.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, d = 1,12 g/ml

3.2. Chlorek cezu

3.3. Azotan glinu Al(NO₃)₃ x 9H₂O

3.4. Chlorek potasu, bezwodny

3.5. Roztwór obciążający. Rozpuścić w wodzie 50 g chlorku cezu (3.2) i 250 g azotanu glinu (3.3), uzupełnić wodą do 1 litra i zamieszać. Przechowywać w plastikowej butelce.

3.6. Roztwór wzorcowy potasu. Rozpuścić 1,907 g chlorku potasu (3.4) i 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), uzupełnić wodą do 1 litra i wymieszać. Przechowywać w plastikowej butelce. 1 ml roztworu zawiera 1 mg potasu.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Tygle do spalań platynowe, kwarcowe lub porcelanowe, zalecane z przykrywkami

4.2. Elektryczny piec do spalań z termostatem

4.3. Fotometr płomieniowy

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Analiza próbki

Odważyć 10 g próbki, z dokładnością do 10 mg, umieścić w tyglu (4.1) i spopielać przez 3 godziny w temperaturze 450°C. Po ochłodzeniu przenieść popiół ilościowo do 500 ml kolby miarowej za pomocą 250 - 300 ml wody, a następnie dodać 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.1). Po uwolnieniu całego ditlenku węgla ogrzać roztwór i utrzymywać 2 godziny w temperaturze 90°C, od czasu do czasu mieszając. Po ochłodzeniu do pokojowej temperatury uzupełnić kolbę do kreski wodą, wstrząsnąć i przesączyć. Przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 ml taką ilość przesączu, która zawiera maksimum 1 mg potasu, dodać 10,0 ml roztworu obciążającego (3.5), uzupełnić do kreski wodą i zamieszać. W przypadku wyższej zawartości potasu rozcieńczyć odpowiednio roztwór analizowany przed dodaniem roztworu obciążającego.

Tabela 4. Przykład dla próbki o masie 10 g

 

Zawartość potasu w próbce (%K)	Rozcieńczenie	Pobrana do oznaczania część roztworu, w ml	Współczynnik rozcieńczenia 1/k
do 0,1	-	50	10
0,1 do 0,5	-	10	50
0,5 do 1,0	-	5	100
1,0 do 5,0	1 : 10	10	500
5,0 do 10,0	1 : 10	5	1.000
10,0 do 20,0	1 : 20	5	2.000

 

Dokonać pomiaru fotometrycznego przy długości fali 768 nm. Obliczyć wynik, korzystając z krzywej kalibracyjnej.

5.2. Krzywa kalibracyjna

Odmierzyć dokładnie 10 ml roztworu podstawowego (3.6) i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Uzupełnić kolbę do kreski wodą i zamieszać. Do kolb miarowych o pojemności 100 ml odmierzyć kolejno 5, 10, 15, 20 i 25 ml roztworu, co odpowiada 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 mg potasu. Dołączyć jeszcze jedną kolbę niezawierającą roztworu podstawowego. Dodać 10 ml roztworu obciążającego (3.5) do każdej kolby, uzupełnić wodą do kreski i wymieszać. Przeprowadzić oznaczenie tak jak w (5.1). Krzywa kalibracyjna ma przebieg liniowy w zakresie do 1 mg na 100 ml wody.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość potasu w procentach wagowych X (%) według wzoru:

       A * R

X(%) = --------,

       m * 10

w którym:

A -  ilość potasu odczytana z krzywej kalibracyjnej, w mg,

R -  współczynnik rozcieńczenia 1/k wskazujący, jaka część roztworu próbki k znajduje się w roztworze pomiarowym,

m - masa próbki, w g.

7. OBJAŚNIENIA

Nie zawsze jest konieczne dodawanie roztworu obciążającego (3.5) w celu wyeliminowania interferencji pierwiastków przeszkadzających.

4.4. OZNACZANIE CHLORKÓW

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania chlorków rozpuszczalnych w wodzie, w przeliczeniu na chlorek sodowy, w paszach.

2. ZASADA METODY

Chlorki są rozpuszczane w wodzie. Jeśli badany produkt zawiera substancje organiczne, roztwór jest klarowany. Po zakwaszeniu kwasem azotowym chlorki strąca się w postaci chlorku srebra po traktowaniu roztworem azotanu srebra. Nadmiar azotanu srebra jest miareczkowany roztworem tiocyjanianu amonu według metody Volharda.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Tiocyjanian amonu, roztwór 0,1 mol/l (0,1 N)

3.2. Azotan srebra, roztwór 0,1 mol/l (0,1 N)

3.3. Nasycony roztwór siarczanu(VI) amonu i żelaza

3.4. Kwas azotowy, d = 1,38 g/ml

3.5. Eter dietylowy

3.6. Aceton

3.7. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynku, Zn(CH₃COOH)₂ x 2H₂O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Dopełnić wodą do 100 ml.

3.8. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g heksacyjanożelazianu(II) potasu [K₄Fe(CN)₆] x 3H₂O. Uzupełnić wodą do 100 ml.

3.9. Węgiel aktywny, bez domieszki chlorków

4. APARATURA I SPRZĘT

Mikser (tumbler), 35 do 40 obr/min

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie roztworu

Zależnie od rodzaju próbki przygotować roztwór według jednej z podanych metod: (5.1.1), (5.1.2) lub (5.1.3). W tym samym czasie przeprowadzić odczynnikową ślepą próbę bez badanej próbki.

5.1.1. Próbki niezawierające substancji organicznej

Odważyć, z dokładnością 1 do mg, nie więcej niż 10 g próbki zawierającej nie więcej niż 3 g chlorków. Odważkę umieścić z 400 ml wody w kolbie miarowej o pojemności 500 ml w temperaturze 20°C. Mieszać trzydzieści minut w mikserze bębnowym, uzupełnić do kreski, zamieszać i przesączyć.

5.1.2. Próbki zawierające organiczną materię, z wyłączeniem przypadków opisanych w (5.1.3).

Odważyć około 5 g próbki, z dokładnością do 1 mg, i wraz z 1 g węgla aktywnego umieścić w 500 ml kolbie miarowej. Dodać 400 ml wody o temperaturze około 20°C i 5 ml roztworu Carreza I (3.7), wymieszać i dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.8). Mieszać przez 30 minut w mikserze, uzupełnić do kreski, wymieszać i przesączyć.

5.1.3. Produkty paszowe po obróbce cieplnej, wytłoki lniane, mąka, produkty bogate w mączkę lnianą i inne bogate w klej roślinny lub substancje koloidalne (np. skrobia częściowo zdekstrynowana).

Przygotować roztwór tak jak w (5.1.2), ale nie sączyć. Zdekantować (jeśli zajdzie potrzeba odwirować). 100 ml cieczy umieścić w kolbie miarowej o pojemności 200 ml. Wymieszać z acetonem (3.6) i uzupełnić kolbę do kreski tym samym rozpuszczalnikiem, wymieszać i przesączyć.

5.2. Miareczkowanie

Przy użyciu pipety przenieść do kolby Erlenmeyera od 25 do 100 ml przesączu (w zależności od przewidywanej zawartości chlorków), otrzymanego jak opisano w (5.1.1), (5.1.2) lub (5.1.3). Pobrana porcja cieczy nie może zawierać więcej niż 150 mg chlorków w 100 ml. Rozcieńczyć w razie potrzeby wodą do objętości nie mniejszej niż 50 ml, dodać 5 ml kwasu azotowego (3.4), 20 ml nasyconego roztworu siarczanu(VI) żelaza i amonu (3.3) i 2 krople roztworu tiocyjanianu amonu (3.1) z biurety ustawionej na zero. Za pomocą biurety wprowadzić roztwór azotanu srebra (3.2) w nadmiarze, tak aby nadmiar wyniósł 5 ml. Dodać 5 ml eteru dietylowego (3.5) i mocno wstrząsać do skoagulowania się osadu. Nadmiar azotanu srebra miareczkować roztworem tiocyjanku amonu (3.1) aż do uzyskania czerwonobrązowej barwy utrzymującej się przez 1 minutę.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Ilość chlorków (W), w przeliczeniu na chlorek sodowy, znajdujących się w określonej objętości przesączu pobranego do miareczkowania obliczyć według następującego wzoru:

W = 5,845 (V₁ - V₂) mg,

gdzie:

V₁ -  objętość dodanego 0,1 N roztworu azotanu srebra, w ml,

V₂ -  objętość 0,1 N roztworu tiocyjanku amonu zużyta do miareczkowania.

Jeżeli ślepa próba wykaże, że 0,1 N roztwór azotanu amonu jest zużywany, należy odjąć tę wartość od objętości (V₁ - V₂).

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Można zastosować miareczkowanie potencjometryczne.

7.2. W przypadku produktów bogatych w oleje i tłuszcze najpierw należy je odtłuścić eterem dietylowym lub eterem naftowym.

7.3. W przypadku analizy mączek rybnych miareczkowanie można prowadzić metodą Mohra.

4.5. OZNACZANIE MAGNEZU

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości magnezu w paszach. Metoda jest szczególnie odpowiednia do oznaczania zawartości magnezu poniżej 5%.

2. ZASADA METODY

Próbka jest spopielana i rozpuszczana w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym. Jeśli próbka nie zawiera substancji organicznych, jest rozpuszczana bezpośrednio w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym. Roztwór jest rozcieńczany, a zawartość magnezu oznaczana metodą spektrofotometrii absorpcji atomowej przy 285,2 nm przez porównanie z roztworami wzorcowymi.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, d = 1,16 g/ml

3.2. Stężony kwas chlorowodorowy, d = 1,19 g/ml

3.3. Drut lub wstążka magnezowa, lub heptahydrat siarczanu magnezu wysuszony w temperaturze pokojowej

3.4. Roztwór soli strontu (chlorek lub azotan), 2,5% strontu (m/V), (76,08 g SrCl₂ x 6H₂O lub 60,38 g Sr(NO₃)₂)

3.5. Wzorcowy roztwór magnezu: odważyć 1 g magnezu oczyszczonego z tlenku, z dokładnością do 1 mg (3.3), lub równoważną ilość (10,143 g) heptahydratu siarczanu magnezu (3.3). Odważkę umieścić w 1.000 ml kolbie miarowej. Dodać 80 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), pozostawić do rozpuszczenia i uzupełnić wodą do kreski. 1l tego roztworu zawiera 1.000 mg magnezu.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Platynowe, kwarcowe lub porcelanowe tygle do spalań

4.2. Elektryczny piec do spalań z termostatem

4.3. Spektrofotometr absorpcji atomowej

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie roztworu próbki

5.1.1. Pasze składające się wyłącznie z substancji mineralnych

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 500 ml zawierającej od 250 do 300 ml wody. Dodać 40 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), doprowadzić do wrzenia i łagodnie gotować przez 30 minut. Schłodzić, uzupełnić wodą do kreski, wymieszać i przesączyć przez suchy karbowany sączek do suchej zlewki. Odrzucić pierwsze 30 ml przesączu. W przypadku obecności krzemu 5 g próbki zalać odpowiednią ilością (15-30 ml) kwasu chlorowodorowego (3.2), odparować do sucha na łaźni wodnej i przenieść do suszarki ustawionej na 105°C na około godzinę. Do osadu dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) i przenieść do 500 ml kolby miarowej za pomocą ciepłej wody. Pozostawić do schłodzenia i uzupełnić objętość wodą. Wymieszać i przesączyć przez suchy karbowany sączek do suchej zlewki. Odrzucić pierwsze 30 ml przesączu.

5.1.2. Pasze składające się głównie z substancji mineralnych

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki i umieścić w tyglu, spopielać w temperaturze 550°C w piecu do spalań aż do uzyskania popiołu wolnego od cząsteczek węglowych, a następnie schłodzić. W celu usunięcia krzemu dodać do popiołu odpowiednią ilość (15 - 30 ml) kwasu chlorowodorowego (3.2), odparować do sucha na łaźni wodnej i umieścić na 1 godzinę w suszarce w temperaturze 105°C.

Do osadu dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) i przenieść do 500 ml kolby miarowej za pomocą ciepłej wody. Pozostawić do schłodzenia i uzupełnić objętość wodą. Wymieszać i przesączyć przez suchy karbowany sączek do suchej zlewki. Odrzucić pierwsze 30 ml przesączu.

5.1.3. Pasze składające się głównie z substancji organicznych

Odważyć 5 g próbki z dokładnością do 1 mg. Umieścić w tyglu i spopielać w temperaturze 550°C w piecu muflowym aż do uzyskania popiołu bez cząsteczek węglowych. Dodać 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.2), odparować do sucha na łaźni wodnej, a następnie suszyć przez godzinę w suszarce w temperaturze 105°C w celu wytrącenia nierozpuszczalnej krzemionki. Popiół potraktować 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) i przenieść do 250 ml kolby miarowej za pomocą ciepłej wody, doprowadzić do wrzenia, pozostawić do ochłodzenia i uzupełnić wodą do kreski. Wymieszać i przesączyć do suchej zlewki przez suchy karbowany sączek. Odrzucić pierwsze 30 ml przesączu.

5.2. Pomiar metodą absorpcji atomowej

Rozcieńczając roztwór wzorcowy (3.5) wodą, przygotować przynajmniej 5 roztworów o wzrastających stężeniach odpowiadających optymalnemu zakresowi pomiaru na spektrofotometrze. Do każdego roztworu dodać po 10 ml roztworu soli strontu (3.4) i uzupełnić wodą do 100 ml. Rozcieńczyć wodą jedną część przesączu otrzymanego w (5.1.1), (5.1.2) lub (5.1.3) tak, aby otrzymać stężenie magnezu mieszczące się w zakresie roztworów odniesienia. Stężenie kwasu chlorowodorowego tego roztworu nie może przekraczać 0,4 mol/l. Dodać 10 ml roztworu soli strontu (3.4) i następnie uzupełnić objętość wodą do 100 ml. Zmierzyć absorpcję roztworu badanego i roztworów odniesienia przy 285,2 nm.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość magnezu w próbce obliczamy przez porównanie z roztworami odniesienia. Wynik wyrazić w procentach próbki.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Dopuszczalna różnica między dwoma powtórzeniami nie może przekraczać 5% wartości względnej.

4.6. OZNACZANIE CAŁKOWITEGO FOSFORU METODĄ FOTOMETRYCZNĄ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości całkowitego fosforu w paszach. Metoda jest szczególnie użyteczna do analizy pasz o niskiej zawartości fosforu. W niektórych przypadkach (produkty bogate w fosfor) dopuszcza się stosowanie metody wagowej.

2. ZASADA METODY

Próbka jest mineralizowana poprzez spalanie (w przypadku materiałów organicznych) lub przez rozpuszczenie w kwasach (w przypadku związków mineralnych i pasz ciekłych) i przeprowadzana do kwaśnego roztworu. Roztwór jest poddawany barwnej reakcji z odczynnikiem molibdenowanadowym. Absorbancja utworzonego żółtego roztworu mierzona jest w spektrofotometrze przy 430 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Węglan wapnia

3.2. Kwas chlorowodorowy, d = 1,1 g/ml (około 6 mol/l)

3.3. Kwas azotowy, d = 1,045 g/ml

3.4. Kwas azotowy, d = 1,38 do 1,42 g/ml

3.5. Kwas siarkowy, d = 1,84 g/ml

3.6. Odczynnik molibdenowanadowy: zmieszać 200 ml roztworu molibdenianu amonu (3.6.1), 200 ml roztworu wanadanu amonu (3.6.2) i 134 ml kwasu azotowego (3.4) w kolbie miarowej, o pojemności 1l. Dopełnić do kreski wodą.

3.6.1. Roztwór heptamolibdenianu(VI) amonu: rozpuścić w gorącej wodzie 100 g tetrahydratu heptamolibdenianu(VI) amonu (NH₄)₆ Mo₇ O₂₄ x 4H₂O.

Dodać 10 ml amoniaku (d = 0,91 g/ml) i dopełnić do 1l wodą.

3.6.2. Roztwór wanadanu(V) amonu: 2,35 g wanadanu(V) amonu NH₄VO₃ rozpuścić w 400 ml gorącej wody. Stale mieszając, dodawać powoli 20 ml rozcieńczonego kwasu azotowego (7 ml HNO₃ (3.4) + 13 ml H₂O) i dopełnić do 1l wodą.

3.7. Wzorcowy roztwór fosforu o stężeniu 1 mg/ml: rozpuścić 4,387 g diwodorofosforanu(V) potasu KH₂PO₄ w wodzie.

Dopełnić wodą do 1l.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Tygle kwarcowe lub porcelanowe

4.2. Piec muflowy z termostatem nastawianym na temperaturę 550°C

4.3. Kolby Kjeldahla o pojemności 250 ml

4.4. Kolby i pipety miarowe

4.5. Spektrofotometr

4.6. Probówki o średnicy 16 mm, z korkiem o średnicy 14,5 mm i o pojemności 25 do 30 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie roztworu

W zależności od rodzaju próbki przygotować roztwór według (5.1.1) lub (5.1.2).

5.1.1. Typowy tok postępowania

Odważyć co najmniej 1 g próbki z dokładnością do 1 mg. Umieścić próbkę w kolbie Kjeldahla, dodać 20 ml kwasu siarkowego (3.5), zamieszać w celu zwilżenia próbki i niedopuszczenia do przyklejania cząstek paszy do ścianek kolby, podgrzać i utrzymywać w stanie wrzenia przez 10 minut. Ostudzić, dodać 2 ml kwasu azotowego (3.4), ostrożnie podgrzać, ponownie ostudzić i dodać nieco więcej kwasu azotowego (3.4), a następnie doprowadzić do wrzenia. Powtarzać tę czynność aż do uzyskania bezbarwnego roztworu. Schłodzić, dodać trochę wody, zdekantować ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukać kolbę gorącą wodą. Ostudzić, dopełnić do kreski, zamieszać i przesączyć.

5.1.2. Próbki zawierające substancje organiczne, wolne od diwodorofosforanu(V) wapnia i diwodorofosforanu(V) magnezu

Odważyć około 2,5 g próbki, z dokładnością do 1 mg, i umieścić w tyglu. Zmieszać dokładnie próbkę z 1 g węglanu wapnia (3.1). Spopielać w piecu w temperaturze 550 ± 5°C do uzyskania popiołu o jasnej lub szarej barwie (niewielkie ilości zwęglonej substancji organicznej nie stanowią problemu). Przenieść popiół do zlewki o pojemności 250 ml. Dodać 20 ml wody, a następnie dodawać kwas chlorowodorowy (3.2) aż do zaprzestania pienienia się. Dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.2). Umieścić zlewkę na łaźni piaskowej i odparować do sucha celem przeprowadzenia krzemionki w postać nierozpuszczalną. Pozostałość rozpuścić w 10 ml kwasu azotowego (3.3) i gotować na łaźni piaskowej przez 5 minut, nie doprowadzając do zupełnego odparowania cieczy. Przenieść ciecz do kolby miarowej o pojemności 500 ml, spłukując kilkakrotnie zlewkę gorącą wodą. Pozostawić do schłodzenia, dopełnić do kreski wodą, zamieszać i przesączyć.

5.2. Wywołanie barwy i pomiar absorbancji

Rozcieńczyć część przesączu otrzymanego według (5.1.1) lub (5.1.2) celem uzyskania roztworu o stężeniu nie większym niż 40 µg/ml. Umieścić 10 ml tego roztworu w probówce (4.6) i dodać 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (3.6). Zamieszać i pozostawić na 10 minut przy temperaturze 20°C.

Zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy 430 nm w stosunku do roztworu otrzymanego przez dodatek 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (3.6) do 10 ml wody.

5.3. Krzywa kalibracyjna

Z roztworu wzorcowego (3.7) przygotować roztwory zawierające odpowiednio 5, 10, 20, 30 i 40 µg fosforu w 1 ml. Pobrać 10 ml każdego z tych roztworów i dodać po 10 ml odczynnika molibdenowanadowego (3.6). Zamieszać i pozostawić na co najmniej 10 minut w temperaturze 20°C. Zmierzyć absorbancję według (5.2). Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając na osi rzędnych wartości absorbancji, a na osi odciętych odpowiadające im ilości fosforu. W zakresie stężeń od 0 do 40 µg/ml krzywa jest prostoliniowa.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Określić zawartość fosforu w badanej próbce za pomocą krzywej wzorcowej. Wyrazić wynik w procentach wagowych.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie powinna przekraczać:

-   3% wartości względnej dla zawartości fosforu mniejszej niż 5%;

-   0,15% wartości bezwzględnej dla zawartości fosforu 5% lub wyższej.

4.7. OZNACZANIE ŻELAZA, MIEDZI, MANGANU I CYNKU

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania żelaza, miedzi, manganu i cynku w paszach. Granice oznaczalności metody wynoszą:

żelazo (Fe): 20 mg/kg,

miedź (Cu): 10 mg/kg,

mangan (Mn): 20 mg/kg,

cynk (Zn): 20 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka jest przeprowadzana do roztworu kwasu chlorowodorowego po spopieleniu organicznego materiału. Mikroelementy: żelazo, miedź, mangan i cynk są oznaczane, po odpowiednim rozcieńczeniu, metodą spektrometrii absorpcji atomowej.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Do przygotowania odczynników i roztworów używanych w postępowaniu analitycznym należy stosować wodę pozbawioną oznaczanych kationów, otrzymaną w drodze podwójnej destylacji w destylarce ze szkła borokrzemowego lub kwarcowego lub otrzymaną w wyniku podwójnego oczyszczania na żywicy jonowymiennej.

Należy stosować odczynniki czyste do analizy (cz.d.a.). Nieobecność oznaczanych pierwiastków w stosowanych odczynnikach i roztworach powinna być sprawdzana poprzez próbę zerową. W przypadku koniecznym należy poddać odczynnik oczyszczeniu przed zastosowaniem.

Zamiast przygotowania roztworów wzorcowych opisanych poniżej, dopuszcza się stosowanie roztworów wzorcowych dostępnych w handlu, w przypadku gdy mają gwarancję i były sprawdzane przed użyciem.

3.1. Kwas chlorowodorowy (d = 1,19 g/ ml)

3.2. Kwas chlorowodorowy (6 mol/l)

3.3. Kwas chlorowodorowy (0,5 mol/l)

3.4. Kwas fluorowodorowy 38 do 40% (V/V), o zawartości żelaza poniżej 1 mg Fe/l i pozostałości po odparowaniu mniejszej niż 10 mg (jako siarczany)/l

3.5. Kwas siarkowy (d = 1,84 g/ml)

3.6. Nadtlenek wodoru cz.d.a. (zawierający około 100 objętości tlenu (30% wagowych))

3.7. Roztwór wzorcowy żelaza (1.000 µg Fe/ml) przygotowany w sposób następujący: rozpuścić 1 g drutu żelaznego w 200 ml kwasu chlorowodorowego 6 mol/l (3.2), dodać 16 ml nadtlenku wodoru (3.6) i dopełnić do jednego litra wodą.

3.7.1. Roboczy roztwór wzorcowy żelaza (100 µg Fe/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (3.7) wodą w stosunku 1:9.

3.8. Roztwór wzorcowy miedzi (1.000 µg Cu/ml) przygotowany w sposób następujący: rozpuścić 1 g sproszkowanej miedzi w 25 ml 6 mol/l kwasu chlorowodorowego (3.2), dodać 5 ml nadtlenku wodoru (3.6) i dopełnić do jednego litra wodą.

3.8.1. Roboczy roztwór wzorcowy miedzi (10 µg Cu/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (3.8) wodą w stosunku 1 do 9, a następnie przez ponowne rozcieńczenie wodą uzyskanego roztworu w takim samym stosunku.

3.9. Roztwór wzorcowy manganu (1000 µg Mn/ml) przygotowany w sposób następujący: rozpuścić 1 g sproszkowanego manganu w 25 ml 6 mol/l kwasu chlorowodorowego (3.2) i dopełnić do jednego litra wodą.

3.9.1. Roboczy roztwór wzorcowy manganu (10 µg/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (3.9) wodą w stosunku 1 do 9, a następnie przez ponowne rozcieńczenie wodą uzyskanego roztworu w takim samym stosunku.

3.10. Wzorcowy roztwór cynku (1000 µg Zn/ml) przygotowany w sposób następujący: rozpuścić 1 g cynku w postaci paska lub wiórków w 25 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i dopełnić do jednego litra wodą.

3.10.1. Roboczy roztwór wzorcowy cynku (10 µg Zn/ml) przygotowany przez rozcieńczenie roztworu wzorcowego (3.10) wodą w stosunku 1 do 9, a następnie przez ponowne rozcieńczenie wodą uzyskanego roztworu w takim samym stosunku.

3.11. Roztwór chlorku lantanu przygotowany w sposób następujący: rozpuścić 12 g tlenku lantanu w 150 ml wody, dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i dopełnić do jednego litra wodą.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Piec muflowy z regulacją temperatury i rejestratorem

4.2. Sprzęt szklany ze szkła borokrzemowego; zalecane jest stosowanie sprzętu szklanego wyłącznie do oznaczania mikroelementów.

4.3. Tygle platynowe lub kwarcowe

4.4. Spektrofotometr absorpcji atomowej o wymaganej czułości i precyzji w zakresie prezentowanej metody

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Próbki zawierające substancję organiczną

5.1.1. Spopielanie i przygotowanie roztworu do analizy⁵⁾

5.1.1.1. Umieścić 5 do 10 g próbki, zważonej z dokładnością do 0,2 mg, w kwarcowym lub platynowym tyglu (4.3) (masę odważki analitycznej należy ustalić na podstawie przybliżonej zawartości pierwiastka śladowego w paszy, uwzględniając czułość stosowanego spektrofotometru, w przypadku pasz ubogich w pierwiastki śladowe może zachodzić konieczność odważenia 10 do 20 g próbki i sporządzenia roztworu o końcowej objętości 100 ml), wysuszyć w suszarce w temperaturze 105°C i wstawić tygiel do zimnego pieca muflowego (4.1). Zamknąć piec (spopielanie powinno być prowadzone w zamkniętym piecu bez dostępu powietrza lub tlenu) i stopniowo podwyższać temperaturę do 450 - 475 °C w czasie około 90 minut. Utrzymywać tę temperaturę od 4 do 16 godzin (np. przez noc) w celu spopielenia organicznego materiału, następnie otworzyć piec i pozostawić do schłodzenia (temperatura według wskazań pirometru nie powinna być wyższa niż 475°C).

Przenieść zawartość tygla przy użyciu 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) do zlewki, dodając kwas powoli i ostrożnie (może zachodzić gwałtowna reakcja uwalniania utworzonego ditlenku węgla). Dodawać kwas chlorowodorowy (3.1) kroplami, mieszając, do zaniku pienienia się mieszaniny. Odparować do sucha, od czasu do czasu mieszając szklaną bagietką.

Następnie dodać do pozostałości 15 ml 6 mol/l kwasu chlorowodorowego (3.2) i około 120 ml wody. Zamieszać prętem szklanym, który pozostawić w zlewce i przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym.

Doprowadzić ostrożnie do wrzenia i pozostawić w tym stanie aż do całkowitego rozpuszczenia rozpuszczalnych cząstek popiołu. Przesączyć przez bezpopiołowy sączek i zebrać przesącz w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Spłukać zlewkę i sączek przy użyciu 5 ml gorącego kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i dwukrotnie gorącą wodą. Dopełnić do kreski wodą (stężenie HCl około 0,5 mol/l).

5.1.1.2. Jeżeli pozostałość na sączku jest czarna (węgiel), wstawić z powrotem do pieca i ponownie spopielać przy temperaturze 450 - 475°C. Spopielanie, które wymaga kilku godzin (około trzech do czterech godzin), należy uważać za zakończone, gdy popiół będzie miał jasną barwę. Rozpuścić pozostałość w około 2 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), odparować do sucha i dodać 5 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2). Podgrzać, przesączyć roztwór do kolby miarowej i dopełnić wodą do kreski (stężenie HCl około 0,5 mol/l).

Przy oznaczaniu mikroelementów ważne jest zachowanie ostrożności przed zanieczyszczeniem, zwłaszcza cynkiem, miedzią i żelazem. Dlatego sprzęt stosowany podczas przygotowania próbki powinien być wolny od zanieczyszczeń tymi metalami. W celu zmniejszenia ogólnego ryzyka zanieczyszczenia należy wykonywać oznaczenie w środowisku pozbawionym kurzu, skrupulatnie czyszcząc wyposażenie i dokładnie myjąc laboratoryjny sprzęt szklany. Zwłaszcza przy oznaczaniu cynku występuje ryzyko zanieczyszczeń, np. ze szkła laboratoryjnego, odczynników, kurzu.

5.1.2. Spektrofotometryczne oznaczanie

5.1.2.1. Przygotowanie roztworów do kalibracji

Dla każdego z oznaczanych pierwiastków przygotować, wychodząc z roboczych roztworów wzorcowych podanych w (3.7.1), (3.8.1), (3.9.1) i (3.10.1), szereg roztworów do kalibracji o stężeniu kwasu chlorowodorowego około 0,5 mol/l i (w przypadku żelaza, manganu i cynku) chlorek lantanu o stężeniu 0,1% La (m/V). Zakres stężeń dla każdego pierwiastka musi odpowiadać zakresowi optymalnej czułości stosowanego spektrofotometru. W poniższych tabelach pokazano przykładowy zakres stężeń roztworów kalibracyjnych; zależnie od typu i czułości spektrofotometru może zachodzić konieczność wyboru innych stężeń.

Żelazo

 

µg Fe/ml	0	0,5	1	2	3	4	5
ml roztworu wzorcowego
roboczego (3.7.1)
(1 ml=100 µg Fe)	0	0,5	1	2	3	4	5
+ ml 6 mol/l HCl(3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) i dopełnić do 100 ml wodą

 

Miedź

 

µg Cu/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml roztworu wzorcowego
roboczego (3.8.1)
(1 ml = 10 µg Cu)	0	1	2	4	6	8	10
+ ml 6 mol/l HCl (3.2)	8	8	8	8	8	8	8
dopełnić do 100 ml wodą

 

Mangan

 

µg Mn/ml	0	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8	1,0
ml roztworu wzorcowego
roboczego (3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn)	0	1	2	4	6	8	10
+ ml 6 mol/l HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) i dopełnić do 100 ml wodą

 

Cynk

 

µg Zn/ml	0	0,05	0,1	0,2	0,4	0,6	0,8
ml roztworu wzorcowego
roboczego (3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn)	0	0,5	1	2	4	6	8
+ ml 6 mol/l HCl (3.2)	7	7	7	7	7	7	7
+ 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) i dopełnić do 100 ml wodą

 

5.1.2.2. Przygotowanie roztworu do analizy

W przypadku oznaczania miedzi, roztwór przygotowany według (5.1.1) może być bezpośrednio wykorzystany. W przypadku konieczności dostosowania jego stężenia do zakresu stężeń roztworów kalibracyjnych, pobrać pipetą część roztworu do kolby miarowej o pojemności 100 ml i dopełnić do kreski kwasem chlorowodorowym 0,5 mol/l (3.3).

Przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku pobrać pipetą część przygotowanego według (5.1.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dodać 10 ml roztworu chlorku lantanu (3.11) i dopełnić do kreski kwasem chlorowodorowym 0,5 mol/l (3.3) zgodnie z (8).

5.1.2.3. Próba odczynnikowa

Próbę odczynnikową przeprowadzić zgodnie z postępowaniem toku analitycznego z pominięciem roztworu próbki. Nie należy stosować roztworu kalibracyjnego "0" jako próby odczynnikowej.

5.1.2.4. Pomiar absorpcji atomowej

Zmierzyć absorpcję atomową roztworów kalibracyjnych i roztworu badanego w utleniającym płomieniu powietrzno-acetylenowym przy następujących długościach fal:

Fe: 248,3 nm,

Cu: 324,8 nm,

Mn: 279,5 nm,

Zn: 213,8 nm.

Każdy pomiar przeprowadzić czterokrotnie.

5.2. Pasze mineralne

Jeżeli próbka paszy nie zawiera substancji organicznych, spopielanie nie jest konieczne. Postępować jak podano w (5.1.1.1) po spopieleniu próbki. Etap odparowania z kwasem fluorowodorowym może być pominięty.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość oznaczanego pierwiastka śladowego, odczytując stężenia z krzywej kalibracyjnej, uwzględniając masę próbki analitycznej, zastosowane rozcieńczenie i wyrazić wynik w mg pierwiastka śladowego na kg próbki.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez tego samego analityka nie powinna przekraczać:

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej, dla zawartości pierwiastka śladowego do 50 mg/kg,

-   10% wyższego wyniku, przy zawartościach pierwiastka śladowego od 50 do 100 mg/kg,

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej, dla zawartości pierwiastka śladowego od 100 do 200 mg/kg,

-   5% wyższego wyniku, dla zawartości pierwiastka śladowego ponad 200 mg/kg.

8. OBJAŚNIENIA

Obecność znacznych ilości fosforanów może interferować przy oznaczaniu żelaza, manganu i cynku. Takie interferencje powinny być skorygowane przez dodatek chlorku lantanu (3.11). Jeżeli wagowy współczynnik Ca + Mg / P > 2, dodatek roztworu chlorku lantanu (3.11) do roztworu analizowanego i roztworów kalibracyjnych może być pominięty.

4.8. OZNACZANIE WĘGLANÓW

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości węglanów, w przeliczeniu na węglan wapnia, w większości pasz. W niektórych przypadkach (np. węglan żelaza) należy zastosować inne postępowanie analityczne.

2. ZASADA METODY

Węglany rozkłada się kwasem chlorowodorowym. Powstały ditlenek węgla zbiera się w wykalibrowanej rurce szklanej, a jego objętość jest porównywana z objętością uwolnioną ze znanej ilości węglanu wapnia w tych samych warunkach.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy, d = 1,10 g/ml

3.2. Węglan wapnia

3.3. Kwas siarkowy, około 0,05 mol/l (0,1 N), zabarwiony czerwienią metylową

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Zestaw aparaturowy Scheiblera-Dietricha (rys. 4) lub podobny

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

W zależności od zawartości węglanów w próbce, zważyć próbkę analityczną o masie podanej poniżej:

-   0,5 g produktu przy zawartościach węglanów od 50 do 100%, wyrażonych jako węglan wapnia,

-   1 g produktu przy zawartościach węglanów od 40 do 50%, wyrażonych jako węglan wapnia,

-   2 do 3 g w przypadków innych produktów.

Próbkę umieścić w specjalnej kolbie aparatu (4), wyposażonej w małą probówkę wykonaną z nietłukącego się szkła zawierającą 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.1) i podłączyć kolbę do aparatury. Kran trójdrożny (5) ustawić tak, aby rurka (1) była podłączona z wyjściem. Używając ruchomej rurki (2) wypełnionej barwnym kwasem siarkowym (3.3) i połączonej z wykalibrowaną rurką (1), ustawić poziom cieczy na wartość zerową. Przekręcić kran (5) tak, aby połączyć rurki (1) i (3), i sprawdzić, czy utrzymywany jest poziom zerowy.

Powoli wlewać kwas chlorowodorowy (3.1) do próbki, przechylając kolbę (4). Wyrównać ciśnienie, obniżając rurkę (2). Potrząsać kolbą (4) aż do całkowitego uwolnienia ditlenku węgla. Przywrócić ciśnienie, doprowadzając ciecz w rurkach (1) i (2) do tego samego poziomu. Po kilku minutach, kiedy ustali się objętość gazu, należy wykonać odczyt. Przeprowadzić test kontrolny w tych samych warunkach z 0,5 g węglanu wapnia (3.2).

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość węglanów, wyrażoną jako procentowa zawartość węglanu wapnia w próbce, obliczyć według wzoru:

V x 100

---------,

T x 2W

gdzie:

V -  ilość ml CO₂ uwolniona z odważki analitycznej próbki,

T -  ilość ml CO₂ uwolniona z 0,5 g CaCO₃,

W -  masa próbki analitycznej, w g.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Jeśli odważka próbki jest większa niż 2 g, należy najpierw wlać do kolby (4) 15 ml wody destylowanej i wymieszać przed rozpoczęciem badania. Do testu kontrolnego należy użyć takiej samej objętości wody.

7.2. Jeżeli zastosowana aparatura wymaga zastosowania innych objętości niż podane powyżej, właściwe dla aparatu Scheiblera-Dietricha, należy ilości badanej próbki i substancji wzorcowej dostosować do posiadanej aparatury.

grafika

rys. 4 Aparat Scheiblera-Dietricha do oznaczania CO₂. Skala 1:8 (wymiary w mm)

4.9. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI WAPNIA, MIEDZI, ŻELAZA, MAGNEZU, MANGANU, POTASU, SODU I CYNKU METODĄ ABSORPCYJNEJ SPEKTROMETRII ATOMOWEJ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości wapnia (Ca), miedzi (Cu), żelaza (Fe), magnezu (Mg), manganu (Mn), potasu (K), sodu (Na) i cynku (Zn) w paszach.

Metoda ma zastosowanie do wszystkich pasz.

Granica oznaczalności pierwiastków wynosi:

K i Na                            500 mg/kg;

Ca i Mg                           50 mg/kg;

Cu, Fe, Mn i Zn                   5 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka analityczna jest rozpuszczana w kwasie chlorowodorowym, w razie konieczności po uprzednim spopieleniu w piecu muflowym w temperaturze 550 ± 15°C. Wszelkie obecne związki krzemu są usuwane przez strącenie i sączenie. Osad jest rozpuszczany w kwasie chlorowodorowym, roztwór rozcieńczany do żądanej objętości, a następnie zasysany do płomienia powietrzno-acetylenowego spektrometru absorpcji atomowej.

Absorbancja każdego pierwiastka jest mierzona przez porównanie z absorbancją roztworów kalibracyjnych tego samego pierwiastka.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Woda, co najmniej o 3. stopniu czystości

3.2. Stężony kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 12 mol/l (r = 1,19 g/ml)

3.3. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 6 mol/l

3.4. Rozcieńczony kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,6 mol/l

3.5. Roztwór azotanu lantanu

Rozpuścić 133 g La(NO₃)₃ x 6H₂O w 1 litrze wody (3.1). Dopuszcza się stosowanie innej soli lantanu, jeśli zawartość lantanu w roztworze będzie taka sama.

3.6. Roztwór chlorku cezu

Rozpuścić 100 g CsCl w 1 litrze wody (3.1). Dopuszcza się stosowanie innej soli cezu, jeśli zawartość cezu w roztworze będzie taka sama.

3.7. Roztwór podstawowy Cu, Fe, Mn i Zn

Zmieszać 100 ml wody (3.1) i 125 ml stężonego kwasu chlorowodorowego (3.2) w 1-litrowej kolbie pomiarowej.

Przygotować następujące odważki:

-   392,9 mg pentahydratu siarczanu(VI) miedzi(II) (CuSO₄ x 5H₂O);

-   702,2 mg heksahydratu siarczanu(VI) amonu i żelaza(II) [(NH₄)₂SO₄ x FeSO₄ x 6H₂O];

-   307,7 mg monohydratu siarczanu(VI) manganu (MnSO₄ x H₂O);

-   439,8 mg heptahydratu siarczanu(VI) cynku (ZnSO₄ x 7H₂O);

Przenieść odważone sole do kolby pomiarowej i rozpuścić w wodzie (3.1). Rozcieńczyć wodą do kreski. Zawartości Cu, Fe, Mn i Zn w tym roztworze podstawowym wynoszą po 100 µg/ml.

Dopuszcza się stosowanie dostępnych w handlu gotowych roztworów wzorcowych.

3.8. Roztwór wzorcowy Cu, Fe, Mn i Zn

Rozcieńczyć 20,0 ml roztworu wzorcowego (3.7) wodą (3.1) do 100 ml w kolbie pomiarowej.

Zawartości Cu, Fe, Mn i Zn w tym roztworze wzorcowym wynoszą po 20 µg/ml. Przygotować roztwór w dniu użycia.

3.9. Roztwór podstawowy Ca, K, Mg i Na

Przygotować następujące odważki:

-   1,907 g chlorku potasu (KCl);

-   2,028 g heptahydratu siarczanu(VI) magnezu (MgSO₄ x 7H₂O);

-   2,542 g chlorku sodu (NaCl).

Przenieść odważone sole do 1-litrowej kolby pomiarowej.

Wlać 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) do zlewki. Odważyć do zlewki 2,497 g węglanu wapnia (CaCO₃).

Nie dopuścić do gwałtownego uwalniania się ditlenku węgla.

Gotować przez 5 min na elektrycznej płytce grzejnej (4.4). Schłodzić i przenieść roztwór do kolby pomiarowej zawierającej odważone sole K, Mg i Na. Rozpuścić sole i rozcieńczyć do kreski rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym (3.4).

Zawartości Ca, K i Na w tym roztworze wynoszą po 1 mg/ml; zawartość Mg w tym roztworze wynosi 200 µg/ml.

Dopuszcza się stosowanie dostępnych w handlu gotowych roztworów wzorcowych.

3.10. Roztwór wzorcowy Ca, K, Mg i Na

Rozcieńczyć 25,0 ml roztworu podstawowego (3.9) rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym (3.4) do 250 ml w kolbie pomiarowej.

Zawartości Ca, K i Na w tym roztworze wynoszą po 100 µg/ml; zawartość Mg w tym roztworze wynosi 20 µg/ml.

Roztwór, przechowywany w polietylenowym naczyniu, zachowuje trwałość przez tydzień po sporządzeniu.

3.11. Roztwór ślepy lantanowo-cezowy

Wlać 5 ml roztworu azotanu(V) lantanu (3.5), 5 ml roztworu chlorku cezu (3.6) i 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) do 100 ml kolby pomiarowej. Rozcieńczyć wodą (3.1) do kreski.

4. APARATURA I SPRZĘT

Przed użyciem przemyć rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym (3.4) wszystkie naczynia pomiarowe, włączając pipety stosowane do przygotowania roztworów wzorcowych.

Jeśli do spopielania używane są zalecane tygle i wyroby szklane, nie jest konieczne ich gotowanie w kwasie chlorowodorowym każdorazowo przez użyciem.

Podstawowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności:

4.1. Waga analityczna, z niepewnością ważenia nie większą niż 0,1 mg

4.2. Tygle do spopielania platynowe, kwarcowe lub porcelanowe, niezanieczyszczone potasem i sodem, o gładkiej powierzchni wewnętrznej, o wymiarach górnej średnicy wewnętrznej od 4 cm do 6 cm, dolnej średnicy wewnętrznej 2 cm do 2,5 cm i wysokości około 5 cm. Przed użyciem gotować w kwasie chlorowodorowym (3.3).

4.3. Naczynia szklane, z twardego borokrzemowego szkła

Przed użyciem gotować w kwasie chlorowodorowym (3.3) i spłukać wodą.

4.4. Elektryczna płytka grzejna lub palnik gazowy

4.5. Wrząca łaźnia wodna

4.6. Piec elektryczny muflowy, umożliwiający utrzymanie temperatury 550 ± 15°C

4.7. Spektrometr absorpcji atomowej, umożliwiający pomiar przy długościach fal wymienionych w (5.6.1) i (5.7.1), wyposażony w palnik powietrzno-acetylenowy i umożliwiający korekcję tła lub pomiar absorpcji tła

4.8. Lampy z katodą wnękową lub lampy bezelektrodowe wyładowcze, do oznaczania Ca, Cu, Fe, K, Mg, Mn, Na i Zn

4.9. Sączki bezpopiołowe

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Stwierdzenie obecności substancji organicznej

Ogrzewać szpatułkę z próbką do badań w płomieniu. Jeżeli próbka do badań topi się bez wydzielania dymu, substancje organiczne są obecne w niewielkich ilościach. Jeżeli próbka do badań zmienia barwę i nie topi się, zawiera substancje organiczne.

5.2. Próbka analityczna

Zależnie od oczekiwanej zawartości, odważyć, z niepewnością nie większą niż 1 mg, do tygla do spalań (4.2) od 1 g do 5 g przygotowanej próbki do badań.

Jeżeli próbka do badań zawiera substancje organiczne (5.1), postępować według (5.3).

Jeżeli próbka do badań nie zawiera substancji organicznych lub zawiera ich niewiele (5.1), postępować według (5.4).

5.3. Spopielanie

Ogrzewać tygiel do spopielania na płytce grzejnej lub nad palnikiem gazowym (4.4) aż do całkowitego zwęglenia próbki.

Nie dopuścić do zapalenia się próbki analitycznej.

Wstawić tygiel do pieca muflowego (4.6), utrzymywanego od 15 min w temperaturze 550°C. Spopielać próbkę przez 3 h w tej temperaturze.

Ostudzić i zwilżyć zawartość tygla 2 ml wody. W przypadku obecności wielu cząstek węgla wysuszyć zawartość tygla nad łaźnią wodną (4.5).

Spopielać przez następne 2 h w piecu muflowym ustawionym na temperaturę 550°C. Ostudzić i dodać 2 ml wody.

5.4. Przeprowadzanie do roztworu

Mieszając, dodawać 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.3), początkowo kroplami do zaniku burzenia (możliwe wydzielanie ditlenku węgla), następnie szybciej. Mieszać ruchem wirowym i ogrzewać zawartość tygla prawie do suchej pozostałości.

Podczas suszenia nie dopuścić do strat z powodu rozprysków. Rozpuścić pozostałość przez ogrzewanie z 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) i przenieść roztwór ilościowo z użyciem kilku 5 ml porcji wody do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml.

Schłodzić, następnie rozcieńczyć wodą do kreski i zamieszać. Pozostawić do opadnięcia cząstek stałych i przesączyć (4.9) roztwór, jeżeli nie uzyska klarowności przez 4 h.

5.5. Roztwór ślepy

Do każdej serii pomiarów przygotować roztwór ślepy bez próbki do badań, zachowując sposób postępowania według (5.2), (5.3) i (5.4).

5.6. Oznaczanie miedzi, żelaza, manganu i cynku

5.6.1. Warunki pomiaru

Przygotować spektrometr absorpcji atomowej (4.7) zgodnie z zaleceniami producenta. Ustalić optymalne warunki pomiarowe dla płomienia powietrzno-acetylenowego. W celu wykonania oznaczeń Cu, Fe, Mn i Zn ustawić następujące długości fal:

Cu: 324,8 nm;

Fe: 248,3 nm;

Mn: 279,5 nm;

Zn: 213,8 nm.

5.6.2. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej

Przygotować serie odpowiednich roztworów kalibracyjnych, rozcieńczając roztwór wzorcowy (3.8) rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym (3.4).

Zmierzyć absorbancję kwasu chlorowodorowego (3.4). Zmierzyć absorbancję roztworów kalibracyjnych i odjąć wartość absorbancji kwasu chlorowodorowego (3.4).

Wykreślić krzywą kalibracyjną, odnosząc skorygowane absorbancje do odpowiadających im zawartościom Cu, Fe, Mn i Zn.

5.6.3. Pomiar badanego roztworu

Zmierzyć, równolegle do roztworów wzorcowych i w identycznych warunkach, absorbancję badanego roztworu (5.4) i roztworu ślepego (5.5). Odjąć ostatnią absorbancję od poprzedniej.

Jeżeli to konieczne, rozcieńczyć część badanego roztworu i roztworu ślepego rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym (3.4), w celu otrzymania absorbancji w liniowym zakresie krzywej kalibracyjnej.

Kontynuować według (Rozdział 6).

5.7. Oznaczanie wapnia, magnezu, potasu i sodu

5.7.1. Warunki pomiaru

Przygotować spektrometr absorpcji atomowej zgodnie z zaleceniami producenta. Ustalić optymalne warunki pomiarowe dla płomienia powietrzno-acetylenowego. W celu wykonania oznaczeń Ca, K, Mg i Na ustawić następujące długości fal:

Ca: 422,6 nm;

K: 766,5 nm;

Mg: 285,2 nm;

Na: 589,6 nm.

5.7.2. Przygotowanie krzywej kalibracyjnej

Rozcieńczyć roztwór wzorcowy (3.10) wodą (3.1). Dodać, na każde 100 ml rozcieńczonego roztworu wzorcowego, 5 ml roztworu azotanu(V) lantanu (3.5), 5 ml roztworu chlorku cezu (3.6) i 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.3). Rozcieńczyć w taki sposób, aby otrzymać odpowiednie roztwory kalibracyjne. Zmierzyć absorbancję roztworu ślepego lantanowo-cezowego (3.11).

Zmierzyć absorbancję roztworów kalibracyjnych i odjąć wartość absorbancji roztworu ślepego lantanowo-cezowego (3.11).

Wykreślić krzywą kalibracyjną, odnosząc skorygowane absorbancje do odpowiadających im zawartości Ca, K, Mg i Na.

5.7.3. Pomiar badanego roztworu

Rozcieńczyć odpowiednią ilość badanego roztworu (5.4) i roztworu ślepego (5.5) wodą (3.1). Dodać, na każde 100 ml rozcieńczonego roztworu, 5 ml roztworu azotanu(V) lantanu (3.5), 5 ml roztworu chlorku cezu (3.6) i 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.3).

Zmierzyć, równolegle do roztworów wzorcowych i w identycznych warunkach, absorbancję rozcieńczonego badanego roztworu i rozcieńczonego roztworu ślepego. Odjąć ostatnią absorbancję od poprzedniej.

Jeżeli to konieczne, rozcieńczyć część badanego roztworu i roztworu ślepego roztworem ślepym lantanowo-cezowym (3.11) w celu otrzymania absorbancji w liniowym zakresie krzywej kalibracyjnej.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość wapnia, miedzi, żelaza, magnezu, manganu, potasu, sodu i cynku, odczytując stężenia z krzywej kalibracyjnej, uwzględniając masę próbki analitycznej i zastosowane rozcieńczenie. Zaokrąglić wynik według tabeli 5 i wyrazić w mg/kg lub w g/kg.

Tabela 5 - Zaokrąglanie obliczonej zawartości

 

Zawartość		Zaokrąglić
od	do	do
5 mg/kg	10 mg/kg	0,1 mg/kg
10 mg/kg	100 mg/kg	1 mg/kg
100 mg/kg	1 g/kg	10 mg/kg
1 g/kg	10 g/kg	100 mg/kg
10 g/kg	100 g/kg	1 g/kg

 

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Powtarzalność

Bezwzględna różnica pomiędzy dwoma niezależnymi wynikami pojedynczych oznaczeń przeprowadzonych tą samą metodą na identycznym badanym materiale, w tym samym laboratorium, przez tego samego pracownika używającego tego samego wyposażenia, w krótkim przedziale czasu, nie powinna w więcej niż 5% przypadków przekroczyć granicy powtarzalności (r) wskazanej w lub wynikającej z tabeli 6 lub tabeli 7.

Tabela 6 - Granica powtarzalności (r) i odtwarzalności (R) dla premiksów

Wartości w mg/kg

 

Pierwiastek	Zawartość pierwiastka		r	R
	od	do
Ca	3.000	300.000	- 0,07 x W	- 0,20 x W
Cu	200	20.000	- 0,07 x W	- 0,13 x W
Fe	500	30.000	- 0,06 x W	- 0,21 x W
K	2.500	30.000	- 0,09 x W	- 0,26 x W
Mg	1.000	100.000	- 0,06 x W	- 0,14 x W
Mn	150	15.000	- 0,08 x W	- 0,28 x W
Na	2.000	250.000	- 0,09 x W	- 0,26 x W
Zn	3.500	15.000	- 0,08 x W	- 0,20 x W
- W jest średnią wyników dwóch oznaczeń, w mg/kg

 

Tabela 7 - Granica powtarzalności (r) i odtwarzalności (R) dla pasz

Wartości w ml/kg

 

Pierwiastek	Zawartość pierwiastka		r	R
	od	do
Ca	5.000	50.000	- 0,07 x W	® 0,28 x W
Cu	10	100	- 0,27 x W	® 0,57 x W
Cu	100	200	- 0,09 x W	® 0,16 x W
Fe	50	1.500	- 0,08 x W	® 0,32 x W
K	5.000	30.000	- 0,09 x W	® 0,28 x W
Mg	1.000	10.000	® 0,06 x W	® 0,16 x W
Mn	15	500	® 0,06 x W	® 0,06 x W
Na	1.000	6.000	® 0,15 x W	- 0,23 x W
Zn	25	500	® 0,11 x W	® 0,06 x W
- W jest średnią wyników dwóch oznaczeń, w mg/kg

 

W tabeli 6 i tabeli 7 granice powtarzalności i odtwarzalności podano w postaci wzorów dla każdego pierwiastka i dla każdego wskazanego zakresu. Współczynnik w tym wzorze jest średnią dla wszystkich badanych próbek w danym zakresie.

W wyjątkowych przypadkach wyższe wartości mogą być otrzymane dla oznaczeń poszczególnych pierwiastków w poszczególnych próbkach. Jednym z powodów tych rozbieżności może być brak homogenności tych próbek.

7.2. Odtwarzalność

Bezwzględna różnica pomiędzy dwoma wynikami pojedynczych oznaczeń przeprowadzonych tą samą metodą na identycznym badanym materiale, w różnych laboratoriach, przez różnych pracowników korzystających z różnego wyposażenia nie powinna w więcej niż 5% przypadków przekraczać granicy odtwarzalności (R) wskazanej w lub wynikającej z tabeli 6 lub tabeli 7.

8. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań powinno zawierać:

- wszystkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próbki;

- metodę pobrania próbki, jeżeli jest znana;

- wynik badania.

4.10. OZNACZANIE SELENU

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości selenu w surowcach i mieszankach paszowych z zastosowaniem absorpcyjnej spektrometrii atomowej i techniki generowania wodorków.

2. ZASADA METODY

Zasada metody polega na mineralizacji próbki paszy na mokro za pomocą kwasu azotowego w obecności azotanu magnezu, a następnie spopieleniu w piecu elektrycznym. Z roztworu powstałego po rozpuszczeniu popiołu w rozcieńczonym kwasie chlorowodorowym wyzwalany jest selenowodór za pomocą borowodorku sodu. Selenowodór zostaje wprowadzony do ogrzewanego atomizera umieszczonego na drodze promieniowania lampy spektrometru z katodą selenową. Na podstawie pomiarów absorbancji przy długości fali 196,0 nm określona zostaje zawartość selenu w próbce paszy.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Podczas badań, jeżeli nie zaznaczono inaczej, należy stosować wyłącznie odczynniki cz.d.a. oraz wodę podwójnie destylowaną lub wodę o równoważnej czystości. Wszystkie szklane naczynia laboratoryjne należy przed przystąpieniem do oznaczania przepłukać roztworem kwasu azotowego (1 + 1), a następnie, co najmniej trzykrotnie, wodą podwójnie destylowaną.

3.1. Kwas azotowy(V), d = 1,40 g/ml

3.2. Kwas chlorowodorowy, roztwór (1 + 9), (V/V)

3.3. Kwas chlorowodorowy, roztwór (1 + 1), (V/V)

3.4. Azotan magnezu (MgNO₃ x 6H₂O), roztwór 40% (m/m)

3.5. Metanol

3.6. Triton X-100, roztwór (1 + 10), (V/V)

3.7. Wodorotlenek sodu, roztwór 2% (m/m)

3.8. Borowodorek sodu (NaBH₄), roztwór 5% (m/m), przygotowany w roztworze wodorotlenku sodu (3.7)

3.9. Roztwór wzorcowy selenu o stężeniu 1 mg/ml

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Spektrofotometr absorpcji atomowej wyposażony w przystawkę do generacji wodorków

4.2. Blok grzejny

4.3. Piec elektryczny z regulacją temperatury

4.4. Tygle kwarcowe o pojemności 100 ml

4.5. Kolby pomiarowe o pojemności 100 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Krzywa wzorcowa

Z roztworu wzorcowego selenu (3.9) przygotować roztwory robocze selenu w zakresie stężeń 0,003 µg/ml; 0,005 µg/ml; 0,010 µg/ml, używając do rozcieńczenia kwasu chlorowodorowego (3.2). Do naczynia reakcyjnego dodać kolejno po 10 ml roztworów wzorcowych roboczych, a następnie włączyć lampę dozującą borowodorek sodu (3.8) i zarejestrować wartość absorbancji.

5.2. Przygotowanie próbki do badań

Z średniej próbki laboratoryjnej przygotować próbkę do badań. Z próbki do badań odważyć do tygla kwarcowego (4.4), z dokładnością do 0,001 g, około 2 g badanego materiału.

5.3. Wykonanie oznaczenia

5.3.1. Mineralizacja próbki

W celu zwilżenia materiału dodać do tygla kwarcowego (4.4) 3 ml metanolu (3.5). Następnie dodawać kolejno 5 kropli roztworu tritonu X-100 (3.6), 10 ml roztworu azotanu magnezu (3.4) i 10 ml stężonego kwasu azotowego (3.1). Wymieszać, przenieść tygiel na płytkę grzejną (4.2) i ogrzewać przez 16 h w temperaturze od 70°C do 80°C. Następnie podnieść temperaturę ogrzewania do 200°C i ogrzewać przez 4 h. Po tym czasie tygiel wraz z zawartością przenieść do zimnego pieca, podnosząc stopniowo temperaturę przez następne 3 h do 500°C. W tej temperaturze mineralizować próbkę przez kolejne 4 h. Po ostudzeniu dodać 20 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.3) i ogrzewać ostrożnie przez 1 h na płycie grzejnej w temperaturze nieprzekraczającej 100°C. Uzupełnić objętość ostudzonej próbki do 20 ml, stosując roztwór kwasu chlorowodorowego (3.3). Zawartość tygla przenieść ilościowo do kolby pomiarowej (4.5), uzupełniając do objętości 100 ml wodą redestylowaną. Czynności podane w (5.3.1) przeprowadzić pod wyciągiem.

5.3.2. Pomiar zawartości selenu

Ustawić parametry pracy spektrometru oraz przystawki do generacji selenowodoru zgodnie z instrukcją obsługi aparatu. Przykładowe parametry pracy aparatu podano w tabeli 8. Umieścić od 1 do 10 ml uzyskanego roztworu (5.3.1) w naczyniu reakcyjnym i uzupełnić do objętości 10 ml roztworem kwasu chlorowodorowego (3.3). Włączyć pompę dozującą borowodorek sodu (3.8). Zarejestrować wartość absorbancji.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość selenu (X), w µg/g w badanej próbce, obliczyć według wzoru:

    h₁ * a * v

X = ------------

    h₂ * b * m

w którym:

h₁ -  wartość absorbancji próbki,

h₂ -  wartość absorbancji wzorca najbliższego badanej próbce,

a -   stężenie roztworu wzorcowego, w µg/ml,

v -   objętość końcowa roztworu po mineralizacji, w ml,

b -   objętość roztworu po mineralizacji pobrana do oznaczania, w ml,

m -   odważka próbki do badań, w g.

Za wynik należy przyjąć średnią arytmetyczną wyników trzech równoległych oznaczeń, których wyniki skrajne różnią się nie więcej niż 15% wartości błędu względnego liczonego w stosunku do wartości średniej. Wynik końcowy podać z dokładnością do 0,01 µg/g.

Tabela 8

Przykładowe parametry pracy spektrofotometru absorpcji atomowej z przystawką do generacji wodorków

 

Wyszczególnienie	Przykładowe dane
Aparat	Spektrofotometr absorpcji atomowej wyposażony w lampę wyładowczą z katoda wnękową selenową, przystawkę do generacji selenowodoru oraz rejestrator potencjometryczny
- długość fali	196,0 nm
- szczelina	2,0 nm
- zasilanie lampy	6 W
- maksymalne stężenie badanej próbki	10 ng/ml
Przystawka do generacji wodorków:
- temperatura kuwety	900°C
- przepływ azotu	250 ml/min

 

Rozdział 5

BADANIE WITAMIN

5.1. OZNACZANIE WITAMINY A METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania witaminy A (retinol) w paszach i premiksach. Metoda pozwala na oznaczenie witaminy A występującej jako trans-retinyl i wszystkich jego izomerów cis. Zawartość witaminy A jest wyrażana w jednostkach międzynarodowych (IU) na kg. Jedna IU odpowiada aktywności 0,300 µg wszystkich izomerów trans-witaminy A w formie alkoholowej lub 0,344 µg wszystkich form trans-octanu witaminy A lub 0,550 µg wszystkich form trans-palmitynianu witaminy A.

Granica oznaczalności metody wynosi 2000 IU witaminy A/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka jest hydrolizowana w etanolowym roztworze wodorotlenku potasu i witamina A ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy A jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z fazą odwróconą (RP-HPLC) przy wykorzystaniu detektora UV lub fluorescencyjnego. Parametry chromatograficzne zostały tak dobrane, że nie zachodzi rozdział pomiędzy trans-witaminą A w formie alkoholowej i jej izomerami.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Etanol, s = 96%

3.2. Eter naftowy, zakres wrzenia 40°C do 60°C

3.3. Metanol

3.4. Roztwór wodorotlenku potasu, b = 50 g/100 ml

3.5. Roztwór askorbinianu sodu, b = 10 g/100 ml (7.7)

3.6. Siarczek sodu, Na₂S * x H₂O (x = 7-9)

3.6.1. Roztwór siarczku sodu, c = 0,5 mol/l w glicerolu, b = 120 g/l (dla x = 9) (zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA)

3.7. Roztwór fenoloftaleiny, b = 2 g/100 ml w etanolu (3.1)

3.8. 2-propanol

3.9. Faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu (3.3) i wody, np. 980 + 20 (v + v). Dokładny współczynnik jest określony przez charakterystykę stosowanej kolumny.

3.10. Azot, wolny od tlenu

3.11. Octan all-trans-witaminy A, o specjalnej czystości i certyfikowanej aktywności, np. 2,80 x 10⁶ IU/g

3.11.1. Roztwór wzorcowy octanu all-trans-witaminy A. Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg octanu witaminy A (3.11) do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w 2-propanolu (3.8) i dopełnić do kreski tym samym rozpuszczalnikiem. Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 1400 IU witaminy A w 1 ml. Dokładną zawartość należy oznaczyć według (5.6.3.1).

3.12. Palmitynian all-trans-witaminy A, o specjalnej czystości i certyfikowanej aktywności, np. 1,80 x 10⁶ IU/g

3.12.1. Roztwór wzorcowy palmitynianu all-trans-witaminy A. Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 80 mg palmitynianu witaminy A (3.12) do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w 2-propanolu (3.8) i dopełnić do kreski tym samym rozpuszczalnikiem. Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 1.400 IU witaminy A w 1 ml. Dokładną zawartość należy oznaczyć według (5.6.3.2).

3.13. 2,6-di-tetra-butylo-4-metylofenol (BHT) (zamiast BHT może być użyty hydrochinon)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Odparowywacz próżniowy

4.2. Szkło laboratoryjne oranżowe

4.2.1. Kolba płaskodenna lub stożkowa, 500 ml, ze szlifem

4.2.2. Kolby pomiarowe z szklanymi korkami, z wąską szyjką, 10, 25, 100 i 500 ml

4.2.3. Rozdzielacze stożkowe, 1.000 ml, ze szklanymi korkami

4.2.4. Kolba gruszkowa, 250 ml, ze szlifem

4.3. Chłodnica zwrotna kulkowa, długość płaszcza 300 mm, z połączeniami szlifowanymi, z nasadką do podłączenia gazu

4.4. Karbowany sączek bibułowy do rozdzielania faz, średnica 185 mm (np. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Wyposażenie HPLC z systemem dozowania

4.5.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm x 4 mm, C₁₈, wypełnienie 5 do 10 µm lub podobne (kryterium poprawności: pojedynczy pik dla wszystkich izomerów retinolu w warunkach HPLC)

4.5.2. Detektor UV lub fluorescencyjny, z możliwością zmiany długości fali

4.6. Spektrofotometr z kwarcowymi kuwetami 10 mm

4.7. Łaźnia wodna z mieszadłem magnetycznym

4.8. Zestaw do ekstrakcji (rys. 5) zawierający:

4.8.1. Cylinder szklany o pojemności 1l, ze szlifem i korkiem

4.8.2. Nasadka szklana ze szlifem z bocznikiem i ruchomą nastawną rurką przesuwającą się przez środek nasadki. Zaleca się, aby nastawna rurka miała zakończenie w kształcie litery U i przeciwległy otwór skierowany ku górze tak, aby górna warstwa cieczy w cylindrze mogła być przeniesiona do rozdzielacza stożkowego.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Witamina A jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Zaleca się, aby wszystkie czynności były przeprowadzane w nieobecności światła (stosując szkło oranżowe lub szkło zabezpieczone folią aluminiową) i tlenu (płukanie strumieniem azotu). Zaleca się, aby podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy było zastąpione azotem (należy zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając korek od czasu do czasu).

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez sito o boku oczka 1 mm, zważając, aby podczas rozdrabniania nie wydzielało się ciepło. Rozdrabnianie należy przeprowadzić tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym przypadku mogą wystąpić straty witaminy A.

5.2. Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy A zważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 2 do 25 g próbki do kolby okrągłodennej lub stożkowej (4.2.1). Dodać kolejno, każdorazowo mieszając, 130 ml etanolu (3.1), około 100 mg BHT (3.13), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (3.6). Założyć chłodnicę (4.3) na kolbę i umieścić kolbę na łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (4.7). Ogrzać do wrzenia i pozwolić na skraplanie się kondensatu w chłodnicy przez 5 minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (3.4) przez chłodnicę (4.3) i pozwolić na skraplanie się kondensatu w chłodnicy przez następne 25 minut, mieszając pod powolnym przepływem azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3. Ekstrakcja

Przenieść, dekantując, zmydlony roztwór, ilościowo spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza 1000 ml (4.2.3) lub do aparatu do ekstrakcji (4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (3.1) i 100 ml eteru naftowego (3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu do ekstrakcji. Proporcja wody i etanolu w łączonych roztworach powinna wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez dwie minuty i pozostawić na dwie minuty.

5.3.1. Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza stożkowego (4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (jeżeli rozdzielenie faz nie następuje, dodać około 10 ml etanolu (3.1), aby usunąć emulsję) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie, używając 100 ml eteru naftowego (3.2) i ponownie 50 ml eteru naftowego (3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu stożkowym, ostrożnie mieszając (aby zapobiec powstawaniu emulsji), 100 ml porcjami wody, a następnie powtórzyć przemywanie kolejnymi porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). W celu usunięcia suspensji wodnej przesączyć przemyty ekstrakt przez suchy karbowany sączek do rozdzielania faz (4.4) do kolby pomiarowej o pojemności 500 ml (4.2.2). Spłukać rozdzielacz przy użyciu 50 ml eteru naftowego (3.2), dopełnić do kreski eterem naftowym (3.2) i dobrze zamieszać.

5.3.2. Ekstrakcja przy użyciu aparatu do ekstrakcji (4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (jeżeli rozdzielenie faz nie następuje, dodać około 10 ml etanolu (3.1), aby usunąć emulsję), zastąpić korek szklanego cylindra (4.8.1) nasadką szklaną ze szlifem (4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez zwiększenie ciśnienia azotu dopływającego przez nasadkę przenieść górną warstwę eteru naftowego do rozdzielacza o pojemności 1.000 ml (4.2.3). Dodać 100 ml eteru naftowego (3.2) do szklanego cylindra, zamknąć i dobrze wymieszać. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza jak poprzednio. Powtórzyć tę czynność, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (3.2), a następnie dwukrotnie porcje 50 ml eteru naftowego (3.2), przenosząc górne warstwy do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego, jak opisano w (5.3.1), i postępować, jak tam podano.

5.4. Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Przenieść część roztworu (otrzymanego według (5.3.1) lub (5.3.2)) do kolby gruszkowej (4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na odparowywaczu próżniowym (4.1) przy obniżonym ciśnieniu (pod próżnią) na łaźni wodnej w temperaturze nie wyższej niż 40°C. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (3.10) i zdjąć kolbę z odparowywacza. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu i szybko rozpuścić pozostałość w znanej ilości metanolu (10-100 ml) (stężenie witaminy A powinno wynosić od 5 IU/ml do 30 IU/ml).

5.5. Oznaczanie za pomocą HPLC

Witamina A jest rozdzielana na kolumnie z fazą odwróconą C₁₈, a stężenie jest mierzone przy użyciu detektora UV (325 nm) lub detektora fluorescencyjnego (wzbudzanie: 325 nm, emisja: 475 nm) (4.5.2).

Zadozować część metanolowego roztworu (np. 20 µl) otrzymanego według (5.4) i eluować fazą ruchomą (3.9). Obliczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnią wysokość piku (powierzchnię) kilku dozowań roztworów kalibracyjnych (5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe warunki oznaczania podano jako przykładowe; inne warunki mogą być zastosowane pod warunkiem, że ich zastosowanie doprowadzi do otrzymania równoważnych wyników:

Kolumna chromatograficzna (4.5.1):    250 mm x 4 mm, faza odwrócona C₁₈,

                                      wypełnienie 5 lub 10 µm lub podobne

Faza ruchoma (3.9):                   Mieszanina metanolu (3.3) i wody,

                                      np. 980 + 20 (v + v)

Przepływ:                             1 - 2 ml/min

Detektor (4.5.2):                     Detektor UV (325 nm) lub fluorescencyjny

                                      (wzbudzenie: 325 nm / emisja 475 nm)

5.6. Kalibracja

5.6.1. Przygotowanie roboczych roztworów wzorcowych

Pobrać pipetą 20 ml podstawowego roztworu wzorcowego octanu witaminy A (3.11.1) lub 20 ml podstawowego roztworu wzorcowego palmitynianu witaminy A (3.12.1) do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml lub kolby stożkowej (4.2.1) i hydrolizować, jak opisano w (5.2), lecz bez dodatku BHT. Następnie ekstrahować eterem naftowym (3.2), jak opisano w (5.3), i dopełnić do 500 ml eterem naftowym (3.2). Odparować 100 ml ekstraktu na odparowywaczu próżniowym (5.4) prawie do sucha, usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (3.10), ponownie rozpuścić pozostałość w 10 ml metanolu (3.3) i zamieszać. Nominalne stężenie tego rozcieńczonego roztworu wzorcowego roboczego wynosi 560 IU witaminy A na ml. Należy oznaczyć dokładną zawartość według (5.6.3.3). Roztwór wzorcowy roboczy należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

Przenieść pipetą 2,0 ml tego roboczego roztworu wzorcowego do kolby pomiarowej o pojemności 20 ml, dopełnić do kreski metanolem (3.3) i zamieszać. Nominalne stężenie tego rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego wynosi 56 IU witaminy A na ml.

5.6.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0; 2,0; 5,0 i 10,0 ml rozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego do serii kolb pomiarowych o pojemności 20 ml, dopełnić do kreski metanolem (3.3) i zamieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,8; 5,6; 14,0 i 28 IU witaminy A na ml.

Zadozować 20 µl każdego roztworu kalibracyjnego i określić średnie wysokości pików (powierzchnie). Wykorzystując średnie wysokości pików (powierzchnie), wykreślić krzywą kalibracyjną, uwzględniając wyniki kontroli UV (5.6.3.3).

5.6.3. Standaryzacja UV roztworów wzorcowych

5.6.3.1. Roztwór wzorcowy podstawowy octanu witaminy A

Pobrać 2,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego octanu witaminy A (3.11.1) do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml (4.2.2) i uzupełnić do kreski 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie roztworu wynosi 56 IU witaminy A na ml. Pobrać 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu octanu witaminy A do kolby pomiarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do kreski 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A na ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (3.8) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji powinno znajdować się pomiędzy 325 a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

IU witaminy A/ml = E₃₂₆ x 19,0

   1%

(E ---- dla octanu witaminy A = 1.530 przy 326 nm

  1 cm                              w 2-propanolu)

5.6.3.2. Roztwór wzorcowy podstawowy palmitynianu witaminy A

Pobrać 2,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego palmitynianu witaminy A (3.12.1) do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml (4.2.2) i uzupełnić do kreski 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie roztworu wynosi 56 IU witaminy A na ml. Pobrać 3,0 ml tego rozcieńczonego roztworu palmitynianu witaminy A do kolby pomiarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do kreski 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A na ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (3.8) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji powinno znajdować się pomiędzy 325 a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

IU witaminy A/ml = E₃₂₆ x 19,0

   1%

(E ---- dla palmitynianu witaminy A = 957 przy 326 nm

  1 cm                               w 2-propanolu)

5.6.3.3. Robocze roztwory wzorcowe witaminy A

Pobrać 3,0 ml nierozcieńczonego roboczego roztworu wzorcowego witaminy A, przygotowanego według (5.6.1), do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml (4.2.2) i uzupełnić do kreski 2-propanolem (3.8). Pobrać 5,0 ml tego roztworu do kolby pomiarowej o pojemności 25 ml i uzupełnić do kreski 2-propanolem (3.8). Nominalne stężenie roztworu wynosi 6,72 IU witaminy A na ml. Zmierzyć spektrum UV tego roztworu względem 2-propanolu (3.8) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 300 nm a 400 nm. Maksimum ekstynkcji powinno znajdować się pomiędzy 325 a 327 nm.

Obliczenie zawartości witaminy A:

IU witaminy A/ml = E ₃₂₆ x 18,3

   1%

(E ---- dla witaminy A w formie alkoholu = 1821 przy 326 nm

  1 cm                                    w 2-propanolu)

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Na podstawie średniej wysokości pików (powierzchni) witaminy A roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w IU/ml z krzywej wzorcowej (5.6.2).

Zawartość witaminy A w IU/kg próbki obliczyć według poniższego wzoru:

    500 x b x V₂ x 1.000

w = ---------------------- [IU/kg],

          V₁ x m

w którym:

b -   stężenie witaminy A w roztworze próbki (5.4), w IU/ml,

V₁ -  objętość roztworu próbki (5.4), w ml,

V₂-   objętość podwielokrotnej części roztworu pobranej w (5.4), w ml,

m -   masa próbki analitycznej, w g.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Dla próbek o niskiej zawartości witaminy A może być użyteczne połączenie ekstraktów eteru naftowego z dwu naważek (zważona ilość: 25 g) w jeden roztwór przeznaczony do oznaczania HPLC.

7.2. Nie zaleca się, aby próbka pobrana do analizy zawierała więcej niż 2 g tłuszczu.

7.3. Jeżeli rozdzielenie faz nie następuje, dodać około 10 ml etanolu (3.1), aby usunąć emulsję.

7.4. W przypadku oleju z dorsza lub innych czystych tłuszczów zaleca się przedłużenie czasu zmydlania do 45 - 60 minut.

7.5. Zamiast BHT może być użyty hydrochinon.

7.6. Przy zastosowaniu zwykłej kolumny (normalne wypełnienie) możliwe jest oddzielenie izomerów retinolu.

7.7. Zamiast roztworu askorbinianu sodu można użyć 150 mg kwasu askorbinowego.

7.8. Zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA.

8. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może być większa niż 15% w odniesieniu do powyższego wyniku.

grafika

rys. 5 Aparat do ekstrakcji (4.8)

Cylinder szklany (4.8.1) (wysokość około 48 cm)

Warstwa eteru naftowego

Warstwa wodna + zmydlona pasza

Nasadka szklana (4.8.2) (długość około 45 cm)

Ruchoma rurka

5.2. OZNACZANIE WITAMINY E METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania witaminy E w paszach i premiksach. Zawartość witaminy E jest wyrażana w mg octanu DL-a-tokoferolu na kg. 1 mg octanu DL-a-tokoferolu odpowiada 0,91 mg DL-a-tokoferolu (witamina E).

Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg witaminy E/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka jest hydrolizowana w etanolowym roztworze wodorotlenku potasu i witamina E ekstrahowana eterem naftowym. Rozpuszczalnik jest usuwany przez odparowanie, a pozostałość rozpuszczana w metanolu i, w razie konieczności, rozcieńczana do wymaganego stężenia. Zawartość witaminy E jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z fazą odwróconą (RP-HPLC) przy wykorzystaniu detektora fluorescencyjnego lub UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Etanol, s = 96%

3.2. Eter naftowy, zakres wrzenia 40°C do 60°C

3.3. Metanol

3.4. Roztwór wodorotlenku potasu, b = 50 g/100 ml

3.5. Roztwór askorbinianu sodu, b = 10 g/100 ml (zamiast roztworu askorbinianu sodu można użyć 150 mg kwasu askorbinowego)

3.6. Siarczek sodu, Na₂S * x H₂O (x = 7 - 9)

3.6.1. Roztwór siarczku sodu, c = 0,5 mol/l w glicerolu, b = 120 g/1 (dla x = 9) (zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA)

3.7. Roztwór fenoloftaleiny, b = 2 g/100 ml w etanolu (3.1)

3.8. Faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu (3.3) i wody, np. 980 + 20 (v + v). Dokładny współczynnik jest określony przez charakterystykę stosowanej kolumny.

3.9. Azot, wolny od tlenu

3.10. Octan DL-a-tokoferolu, o specjalnej czystości i certyfikowanej aktywności

3.10.1. Roztwór wzorcowy octanu DL-a-tokoferolu. Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg octanu DL-a-tokoferolu (3.10) do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w etanolu (3.1) i dopełnić do kreski tym samym rozpuszczalnikiem. 1 ml tego roztworu zawiera 1 mg octanu DL-a-tokoferolu (kontrola UV zgodnie z (5.6.1.3); stabilizacja zgodnie z (7.4)).

3.11. DL-a-tokoferol, o specjalnej czystości i certyfikowanej aktywności

3.11.1. Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg DL-a-tokoferolu (3.10) do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Rozpuścić w etanolu (3.1) i dopełnić do kreski tym samym rozpuszczalnikiem. 1 ml tego roztworu zawiera 1 mg DL-a-tokoferolu (kontrola UV zgodnie z (5.6.2.3); stabilizacja zgodnie z (7.4)).

3.12. 2,6-Di-tetra-butylo-4-metylofenol (BHT) (zamiast BHT może być użyty hydrochinon)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Odparowywacz próżniowy

4.2. Szkło laboratoryjne oranżowe

4.2.1. Kolba płaskodenna lub stożkowa, 500 ml, ze szlifem

4.2.2. Kolby pomiarowe ze szklanymi korkami, z wąską szyjką, 10, 25, 100 i 500 ml

4.2.3. Rozdzielacze stożkowe, 1.000 ml, ze szklanymi korkami

4.2.4. Kolba gruszkowa, 250 ml, ze szlifem

4.3. Chłodnica zwrotna kulkowa, długość płaszcza 300 mm, z połączeniami szlifowanymi, z nasadką do podłączenia gazu

4.4. Karbowany sączek bibułowy do rozdzielania faz, średnica 185 mm (np. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Wyposażenie HPLC z systemem dozowania

4.5.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm x 4 mm, C₁₈, wypełnienie 5 do 10 µm lub podobne (kryterium poprawności: pojedynczy pik dla wszystkich izomerów retinolu w warunkach HPLC)

4.5.2 Detektor UV lub fluorescencyjny, z możliwością zmiany długości fali

4.6. Spektrofotometr z kwarcowymi kuwetami 10 mm

4.7. Łaźnia wodna z mieszadłem magnetycznym

4.8. Zestaw do ekstrakcji (rys. 5) zawierający:

4.8.1. Cylinder szklany o pojemności 1l, ze szlifem i korkiem

4.8.2. Nasadkę szklaną ze szlifem z bocznikiem i ruchomą nastawną rurką przesuwającą się przez środek nasadki. Zaleca się, aby nastawna rurka miała zakończenie w kształcie litery U i przeciwległy otwór skierowany ku górze tak, aby górna warstwa cieczy w cylindrze mogła być przeniesiona do rozdzielacza stożkowego.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Witamina E jest wrażliwa na światło (UV) i utlenianie. Zaleca się, aby wszystkie czynności były przeprowadzane w nieobecności światła (stosując szkło oranżowe lub szkło zabezpieczone folią aluminiową) i tlenu (płukanie strumieniem azotu). Zaleca się, aby podczas ekstrakcji powietrze znad cieczy było zastąpione azotem (należy zapobiegać zbyt wysokiemu ciśnieniu, zwalniając korek od czasu do czasu).

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez sito o boku oczka 1 mm, zważając, aby podczas rozdrabniania nie wydzielało się ciepło. Rozdrabnianie należy przeprowadzić tuż przed ważeniem i zmydlaniem, gdyż w przeciwnym przypadku mogą wystąpić straty witaminy E.

5.2. Zmydlanie

W zależności od zawartości witaminy E zważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 2 do 25 g próbki do kolby okrągłodennej lub stożkowej (4.2.1). Dodać kolejno, każdorazowo mieszając, 130 ml etanolu (3.1), około 100 mg BHT (3.12), 2 ml roztworu askorbinianu sodu (3.5) i 2 ml roztworu siarczku sodu (3.6). Założyć chłodnicę (4.3) na kolbę i umieścić kolbę na łaźni wodnej z mieszadłem magnetycznym (4.7). Ogrzać do wrzenia i pozwolić na skraplanie się kondensatu w chłodnicy przez 5 minut. Następnie dodać 25 ml roztworu wodorotlenku potasu (3.4) przez chłodnicę (4.3) i pozwolić na skraplanie się kondensatu w chłodnicy przez następne 25 minut, mieszając pod powolnym przepływem azotu. Następnie spłukać chłodnicę około 20 ml wody i schłodzić zawartość kolby do temperatury pokojowej.

5.3. Ekstrakcja

Przenieść, dekantując, zmydlony roztwór, ilościowo spłukując 250 ml wody, do rozdzielacza 1.000 ml (4.2.3) lub do aparatu do ekstrakcji (4.8). Spłukać kolbę po zmydlaniu kolejno 25 ml etanolu (3.1) i 100 ml eteru naftowego (3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza lub do aparatu do ekstrakcji. Proporcja wody i etanolu w łączonych roztworach powinna wynosić około 2:1. Wstrząsać energicznie przez dwie minuty i pozostawić na dwie minuty.

5.3.1. Ekstrakcja przy użyciu rozdzielacza stożkowego (4.2.3)

Po rozdzieleniu warstw (jeżeli rozdzielenie faz nie następuje, dodać około 10 ml etanolu (3.1), aby usunąć emulsję) przenieść warstwę eteru naftowego do innego rozdzielacza (4.2.3). Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie, używając 100 ml eteru naftowego (3.2) i ponownie 50 ml eteru naftowego (3.2).

Przemyć dwukrotnie połączone ekstrakty w rozdzielaczu stożkowym, ostrożnie mieszając (aby zapobiec powstawaniu emulsji), 100 ml porcjami wody, a następnie powtórzyć przemywanie kolejnymi porcjami wody, aż woda pozostanie bezbarwna po dodaniu roztworu fenoloftaleiny (3.7) (wystarczy zwykle czterokrotne przemycie). W celu usunięcia suspensji wodnej przesączyć przemyty ekstrakt przez suchy karbowany sączek do rozdzielania faz (4.4) do kolby pomiarowej o pojemności 500 ml (4.2.2). Spłukać rozdzielacz przy użyciu 50 ml eteru naftowego (3.2), dopełnić do kreski eterem naftowym (3.2) i dobrze zamieszać.

5.3.2. Ekstrakcja przy użyciu aparatu do ekstrakcji (4.8)

Gdy warstwy zostaną rozdzielone (jeżeli rozdzielenie faz nie następuje, dodać około 10 ml etanolu (3.1), aby usunąć emulsję), zastąpić korek szklanego cylindra (4.8.1) nasadką szklaną ze szlifem (4.8.2) i ustawić niższy koniec rurki w kształcie litery U tak, aby znajdował się tuż ponad granicą rozdziału faz. Przez zwiększenie ciśnienia azotu dopływającego przez nasadkę przenieść górną warstwę eteru naftowego do rozdzielacza o pojemności 1.000 ml (4.2.3). Dodać 100 ml eteru naftowego (3.2) do szklanego cylindra, zamknąć i dobrze wymieszać. Pozostawić do rozdzielenia się faz i przenieść górną warstwę do rozdzielacza jak poprzednio. Powtórzyć tę czynność, stosując kolejną porcję 100 ml eteru naftowego (3.2), następnie dwukrotnie z porcjami 50 ml eteru naftowego (3.2), przenosząc górne warstwy do rozdzielacza.

Przemyć połączone ekstrakty eteru naftowego, jak opisano w (5.3.1), i postępować, jak tam podano.

5.4. Przygotowanie roztworu próbki do HPLC

Przenieść część roztworu (otrzymanego według (5.3.1) lub (5.3.2)) do kolby gruszkowej (4.2.4). Odparować rozpuszczalnik prawie do sucha na odparowywaczu próżniowym (4.1) przy obniżonym ciśnieniu na łaźni wodnej w temperaturze nie wyższej niż 40°C. Przywrócić ciśnienie atmosferyczne przez wpuszczenie azotu (3.10) i zdjąć kolbę z odparowywacza. Usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu i szybko rozpuścić pozostałość w znanej ilości metanolu (10 - 100 ml) (stężenie DL-a-tokoferolu powinno wynosić od 5 µ/ml do 30 µ/ml).

5.5. Oznaczanie za pomocą HPLC

Witamina E jest rozdzielana na kolumnie z fazą odwróconą C₁₈ (4.5.1), a stężenie jest mierzone przy użyciu detektora fluorescencyjnego (wzbudzanie: 295 nm, emisja: 330 nm) lub detektora UV (292 nm) (4.5.2).

Zadozować część metanolowego roztworu (np. 20 µl) otrzymanego według (5.4) i eluować fazą ruchomą (3.8). Obliczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) kilku kolejnych dozowań tego samego roztworu próbki i średnią wysokość piku (powierzchnię) kilku dozowań roztworów kalibracyjnych (5.6.2).

Warunki HPLC

Poniższe warunki oznaczania podano jako przykładowe; inne warunki mogą być zastosowane pod warunkiem, że ich zastosowanie doprowadzi do otrzymania równoważnych wyników:

Kolumna chromatograficzna (4.5.1):    250 mm x 4 mm, faza odwrócona C₁₈,

                                      wypełnienie 5 lub 10 µm lub podobne

Faza ruchoma (3.8):                   Mieszanina metanolu (3.3) i wody, np.

                                      980 + 20 (v + v)

                                      Przepływ: 1 - 2 ml/min

Detektor (4.5.2):                     Detektor fluorescencyjny (wzbudzenie:

                                      295 nm / emisja: 330 nm) lub

                                      detektor UV (292 nm).

5.6. Kalibracja (octan DL-a-tokoferolu lub DL-a-tokoferol)

5.6.1. Wzorzec octanu DL-a-tokoferolu

5.6.1.1. Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Przenieść pipetą 25 ml podstawowego roztworu wzorcowego octanu DL-a-tokoferolu (3.10.1) do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml lub kolby stożkowej (4.2.1) i hydrolizować, jak opisano w (5.2). Następnie ekstrahować eterem naftowym (3.2), jak opisano w (5.3), i dopełnić do 500 ml eterem naftowym (3.2). Odparować 25 ml ekstraktu na odparowywaczu próżniowym zgodnie z (5.4) prawie do sucha, usunąć pozostały rozpuszczalnik strumieniem azotu (3.9), ponownie rozpuścić pozostałość w 25 ml metanolu (3.3) i zamieszać. Nominalne stężenie tego rozcieńczonego roztworu wzorcowego roboczego wynosi 45,5 µg DL-a-tokoferolu na ml, co odpowiada 50 µg octanu DL-a-tokoferolu na ml. Roboczy roztwór wzorcowy należy przygotować tuż przed użyciem.

5.6.1.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0; 2,0; 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do serii kolb pomiarowych o pojemności 20 ml, dopełnić do kreski metanolem (3.3) i zamieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,5; 5,0; 10,0 i 25 µg/ml octanu DL-a-tokoferolu, tj. 2,28; 4,55; 9,10 i 22,8 µg/ml DL-a-tokoferolu.

Zadozować 20 µl każdego roztworu kilka razy i określić średnie wysokości pików (powierzchnie). Wykorzystując średnie wysokości pików (powierzchnie), wykreślić krzywą kalibracyjną.

5.6.1.3. Standaryzacja UV roztworu wzorcowego octanu DL-a-tokoferolu (3.10.1)

Rozcieńczyć 5,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego octanu DL-a-tokoferolu (3.10.1) do 25,0 ml etanolem i zdjąć spektrum UV tego roztworu wobec etanolu (3.1) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 250 nm i 320 nm.

Maksimum absorpcji powinno wystąpić przy 284 nm:

  1%

E ----- = 43,6 przy 284 nm w etanolu

 1 cm

Przy tym rozcieńczeniu wartość ekstynkcji powinna wynosić od 0,84 do 0,88.

5.6.2. Wzorzec DL-a-tokoferolu

5.6.2.1. Przygotowanie roboczego roztworu wzorcowego

Przenieść pipetą 2,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego DL-a-tokoferolu (3.11.1) do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml, rozpuścić w metanolu (3.3) i dopełnić do kreski metanolem. Nominalne stężenie tego roztworu wynosi 40 µg DL-a-tokoferolu na ml, co odpowiada 44,0 µg octanu DL-a-tokoferolu na ml. Roboczy roztwór wzorcowy należy przygotować tuż przed użyciem.

5.6.2.2. Przygotowanie roztworów kalibracyjnych i krzywej kalibracyjnej

Przenieść 1,0; 2,0; 4,0 i 10,0 ml roboczego roztworu wzorcowego do serii kolb pomiarowych o pojemności 20 ml, dopełnić do kreski metanolem (3.3) i zamieszać. Nominalne stężenia tych roztworów wynoszą 2,0; 4,0; 8,0 i 20,0 µg/ml DL-a-tokoferolu, tj. 2,20; 4,40; 8,79 i 22,0 µg/ml octanu DL-a-tokoferolu.

Zadozować 20 µl każdego roztworu kilka razy i określić średnie wysokości pików (powierzchnie). Wykorzystując średnie wysokości pików (powierzchnie), wykreślić krzywą kalibracyjną.

5.6.2.3. Standaryzacja UV roztworu wzorcowego DL-a-tokoferolu (3.11.1)

Rozcieńczyć 2,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego DL-a-tokoferolu (3.11.1) do 25,0 ml etanolem i zdjąć spektrum UV tego roztworu wobec etanolu (3.1) w spektrofotometrze (4.6) pomiędzy 250 nm i 320 nm.

Maksimum absorpcji powinno wystąpić przy 292 nm.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Na podstawie średniej wysokości pików (powierzchni) witaminy E roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w µg/ml (w odniesieniu do octanu DL-a-tokoferolu), w ml z krzywej wzorcowej ((5.6.1.2) lub (5.6.2.2)).

Zawartość witaminy E w mg/kg próbki obliczyć według poniższego wzoru:

    500 x b x V₂

w = -------------- [IU/kg],

      V₁ x m

w którym:

b -   stężenie witaminy E w roztworze próbki (5.4), w µg/ml,

V₁ -  objętość roztworu próbki (5.4), w ml,

V₂ -  objętość podwielokrotnej części roztworu pobranej w (5.4), w ml,

m -   masa próbki analitycznej, w g.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Dla próbek o niskiej zawartości witaminy E może być użyteczne połączenie ekstraktów eteru naftowego z dwu naważek (zważona ilość: 25 g) w jeden roztwór przeznaczony do oznaczania HPLC.

7.2. Nie zaleca się, aby próbka pobrana do analizy zawierała więcej niż 2 g tłuszczu.

7.3. Jeżeli rozdzielenie faz nie następuje, dodać około 10 ml etanolu (3.1), aby usunąć emulsję.

7.4. Po pomiarze spektrofotometrycznym roztworu octanu DL-a-tokoferolu lub DL-a-tokoferolu, otrzymanego odpowiednio według (5.6.1.3) lub (5.6.2.3), dodać 10 mg BHT (3.12) do roztworu ((3.10.1) lub (3.10.2)) i przechowywać roztwór w lodówce (maksimum 4 tygodnie).

7.5. Zamiast BHT może być użyty hydrochinon.

7.6. Przy zastosowaniu zwykłej kolumny (normalne wypełnienie) możliwe jest oddzielenie a-, b-, c- i d-tokoferolu.

7.7. Zamiast roztworu askorbinianu sodu można użyć 150 mg kwasu askorbinowego.

7.8. Zamiast roztworu siarczku sodu można zastosować około 50 mg EDTA.

8. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może być większa niż 15% w odniesieniu do powyższego wyniku.

5.3. OZNACZANIE MENADIONU (WITAMINA K₃)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości menadionu (witaminy K₃) w paszach, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 1 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Ekstrakcja próbki rozcieńczonym etanolem. Klarowanie mieszaniny roztworem taniny i wirowanie. Zadawanie ekstraktu roztworem węglanu sodu i ekstrakcja uwolnionego menadionu 1,2-dichloroetanem. Ekstrakt dichloroetanowy, w zależności od zawartości menadionu, zadaje się bezpośrednio lub po odparowaniu etanolowym roztworem 2,4-dinitrofenylohydrazyny zakwaszonym kwasem chlorowodorowym. Otrzymany hydrazon w nadmiarze amoniaku tworzy niebieskozielony kompleks, którego gęstość optyczna jest mierzona przy 635 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Etanol, 96% (V/V)

3.2. Etanol (3.1) rozcieńczony wodą do stężenia 40% (V/V)

3.3. Roztwór taniny o stężeniu 10% (w/v), otrzymany ze sproszkowanej i oczyszczonej taniny

3.4. 1.2-dichloroetan

3.5. Roztwór bezwodnego węglanu sodu o stężeniu 10% (w/v)

3.6. Kwas chlorowodorowy, 37% (w/v), d = 1,19 g/ml

3.7. Bezwodny etanol

3.8. Odczynnik 2,4-dinitrofenylohydrazyny: Rozpuścić 40 mg 2,4-dinitrofenylohydrazyny cz.d.a. w około 40 ml wrzącego bezwodnego etanolu (3.7), schłodzić i przenieść do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml. Dodać 1 ml kwasu chlorowodorowego (3.6) i uzupełnić do kreski bezwodnym etanolem (3.7). Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.9. Amoniak, 25% (w/v), d = 0,91 g/ml

3.10. Amoniakalny etanol: zmieszać jedną objętość etanolu (3.7) z jedną objętością amoniaku (3.9).

3.11. Roztwory wzorcowe menadionu. Rozpuścić 20 mg menadionu (witaminy K₃) w 1,2-dichloroetanie (3.4) i uzupełnić do 200 ml. Rozcieńczyć część tego roztworu podstawowego w 1,2-dichloroetanie w celu otrzymania serii roztworów o stężeniu menadionu od 2 do 10 µg/ml. Roztwory należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Wstrząsarka mechaniczna

4.2. Wirówka, od 3.000 do 5.000 obr/min

4.3. Rozdzielacze o pojemności 100 i 250 ml ze szklanymi, szlifowanymi korkami

4.4. Obrotowy odparowywacz próżniowy z kolbami o pojemności 250 ml

4.5. Łaźnia wodna

4.6. Spektrofotometr z kuwetami o 10 mm warstwie pomiarowej

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Wszystkie operacje należy wykonywać z dala od bezpośredniego światła; w razie potrzeby stosować aparaturę wykonaną ze szkła oranżowego.

5.1. Próbka analityczna

Z dokładnie podzielonej i rozdrobnionej próbki odważyć próbkę analityczną o masie zależnej od przewidywanej zawartości menadionu:

-   0,1 do 5,0 g w przypadku koncentratów i premiksów;

-   20 do 30 g w przypadku mieszanek paszowych.

Próbkę analityczną umieścić niezwłocznie w kolbie o pojemności 250 ml, ze szklanym korkiem.

5.2. Ekstrakcja

Do próbki analitycznej dodać dokładnie 96 ml rozcieńczonego etanolu (3.2) i wstrząsać mechanicznie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 4,0 ml roztworu taniny (3.3), zamieszać i przenieść ekstrakt do probówki wirówkowej. Wirować przy 3.000 do 5.000 obr/min i zdekantować.

Odmierzyć 20 do 40 ml ekstraktu do rozdzielacza o pojemności 250 ml, dodać pipetą 50 ml 1,2-dichloroetanu (3.4), zamieszać i dodać pipetą 20 ml roztworu węglanu sodowego (3.5). Energicznie wstrząsać przez 30 sekund, a następnie zebrać fazę dichloroetanową w rozdzielaczu o pojemności 100 ml. Dodać 20 ml wody, ponownie wstrząsać przez 15 sekund, zebrać dichloroetanową fazę i usunąć resztki wody za pomocą skrawków bibuły.

W przypadku analizy koncentratów i premiksów pobrać część ekstraktu i rozcieńczyć 1,2-dichloroetanem (3.4) w celu otrzymania stężenia menadionu od 2 do 10 µg/ml. W przypadku mieszanek paszowych, część ekstraktu odparować do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem w atmosferze azotu, na łaźni wodnej w temperaturze 40°C. Pozostałość natychmiast rozpuścić w 1,2-dichloroetanie (3.4) tak, aby otrzymać roztwór o stężeniu menadionu od 2 do 10 µg/ml.

5.3. Tworzenie hydrazonu

Przenieść 2,0 ml dichloroetanowego ekstraktu otrzymanego według (5.2) do kolby miarowej o pojemności 10 ml, dodać 3 ml odczynnika 2,4-dinitrofenylohydrazonowego (3.8), natychmiast zamknąć kolbę korkiem zwykłym lub teflonowym, aby zapobiec odparowaniu, a następnie ogrzewać przez dwie godziny w temperaturze 70°C na łaźni wodnej. Po ochłodzeniu dodać 3 ml amoniakalnego etanolu (3.10), zamieszać, dopełnić kolbę do kreski bezwodnym etanolem (3.7) i ponownie zamieszać.

5.4. Pomiar gęstości optycznej

Zmierzyć gęstość optyczną niebieskozielonego kompleksu na spektrofotometrze przy 635 nm, stosując jako roztwór odniesienia próbę odczynnikową, otrzymaną przez traktowanie 2 ml 1,2-dichloroetanu (3.4), tak jak podano w (5.3).

Określić ilość menadionu z krzywej kalibracyjnej sporządzanej dla każdej serii analiz.

5.5. Krzywa kalibracyjna

Odmierzyć 2,0 ml wzorcowego roztworu menadionu (3.11) i postępować jak w (5.3). Zmierzyć gęstość optyczną, tak jak podano w (5.4). Wykreślić krzywą kalibracyjna, umieszczając na osi rzędnych wartości absorbancji, a na osi odciętych ilości menadionu w µg.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość menadionu w próbce, uwzględniając masę próbki analitycznej i rozcieńczenia w toku analizy, według wzoru:

    A * R

X = -------,

      m

w którym:

X -   zawartość menadionu, w mg/kg,

A -   ilość menadionu odczytana z krzywej kalibracyjnej, w µg,

R -   współczynnik rozcieńczenia,

m -   masa próbki analitycznej, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekroczyć:

-   20% wartości względnej, przy zawartościach menadionu mniejszych niż 10 mg/kg;

-   2 ppm wartości bezwzględnej, przy zawartościach menadionu od 10 do 14 mg/kg;

-   15% wartości względniej, przy zawartościach menadionu od 14 do 100 mg/kg;

-   15 ppm wartości bezwzględnej, przy zawartościach menadionu od 100 do 150 mg/kg;

-   10% wartości względnej, przy zawartościach menadionu powyżej niż 150 mg/kg.

5.4. OZNACZANIE TIAMINY (WITAMINA B₁)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości tiaminy (aneuryna, witamina B₁) w paszach, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 5 mg/kg (5 ppm).

2. ZASADA METODY

Ekstrakt poddaje się na gorąco działaniu rozcieńczonego kwasu siarkowego i następnie hydrolizie enzymatycznej. Otrzymany roztwór utlenia się w środowisku alkalicznym. Utworzony tiochrom ekstrahuje się izobutanolem i oznacza fluorymetrycznie.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Roztwór wzorcowy tiaminy o stężeniu 100 µg/ml. Rozpuścić 112,3 mg chlorowodorku tiaminy, uprzednio wysuszonego pod próżnią do stałej wagi, w 1.000 ml roztworu kwasu siarkowego o stężeniu 0,1 mol/l (3.2). Roztwór, przechowywany w chłodnym ciemnym miejscu, zachowuje trwałość przez 1 miesiąc.

3.2. Kwas siarkowy, roztwór o stężeniu 0,1 mol/l (0,2 N)

3.3. Disiarczek sodu, czysty

3.4. Roztwór heksacyjanożelazianu(II) potasu o stężeniu 20% (w/v)

3.5. Roztwór wodorotlenku potasu 25% (w/v)

3.6. Mieszanina utleniająca: zmieszać 2 ml roztworu heksacyjanożelazianu(II) potasu (3.4) z 48 ml roztworu wodorotlenku potasu (3.5). Mieszaniny nie przechowywać dłużej niż 4 godziny.

3.7. Isobutanol, cz.d.a.

3.8. Roztwór octanu sodu, roztwór o stężeniu 2,5 mol/l (2,5 N)

3.9. Preparat wieloenzymatyczny zawierający proteazę, fosfatazę i amylazę, np. Claraza

3.10.Etanol, 96% (V/V)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Łaźnia wodna

4.2. Wirówka (3.500 obr/min) z probówkami wirówkowymi, ze szklanymi korkami, o pojemności od 30 do 50 ml

4.3. Fluorymetr

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Hydroliza enzymatyczna

W dwu kolbach miarowych o pojemności 250 ml, oznakowanych jako A i B, umieścić dwie identyczne odważki analityczne próbki zawierające około 100 µg tiaminy i dodać do każdej kolby 125 ml kwasu siarkowego (3.2). Tylko do kolby A dodać l ml roztworu wzorcowego (3.1) (wzorzec wewnętrzny). Wstrząsnąć energicznie i umieścić kolby na wrzącej łaźni wodnej na 15 minut, od czasu do czasu wstrząsając. Ochłodzić do temperatury około 45°C. Do każdej kolby dodać po 20 ml roztworu octanu sodu (3.8) i 0,5 g preparatu wieloenzymatycznego (3.9), a następnie pozostawić na 20 minut w temperaturze pokojowej. Po czym dodać po 20 ml roztworu octanu sodu (3.8), uzupełnić wodą do kreski, dokładnie wymieszać i przesączyć. Zebrać przesącze A i B po odrzuceniu pierwszych 15 ml przesączu. Przygotować następujące roztwory:

5.1.1. Roztwór odniesienia T

Umieścić w probówce wirówkowej (4.2) 5 ml przesączu A i dodać około 10 mg disiarczku sodu (3.3). Probówkę umieścić na 15 minut na wrzącej łaźni wodnej, a następnie schłodzić do temperatury pokojowej.

5.1.2. Roztwory A (wzorzec wewnętrzny) i B (próbka)

Umieścić 5 ml przesączu A w probówce wirówkowej (4.2) i 5 ml przesączu B w innej probówce wirówkowej (4.2).

5.2. Utlenianie

Do roztworów T, A i B dodać po 5 ml mieszaniny utleniającej (3.6) i minutę później po 10 ml izobutanolu (3.7). Zamknąć probówki korkiem i wstrząsać energicznie przez 5 sekund. Pozostawić na minutę i odwirować do oddzielenia warstw. Z każdej probówki przenieść po 5 ml izobutanolowego roztworu do kolb miarowych o pojemności 25 ml, dopełnić kolby do kreski etanolem (3.10) i wymieszać ekstrakty T, A i B.

5.3. Pomiar fluorescencyjny

Przeprowadzić pomiar przy takiej długości fali, przy której na fluorymetrze odczytujemy najwyższą fluorescencję tiochromu. Naświetlać przy długości fali promieniowania około 365 nm.

Za pomocą roztworu T ustalić zero fluorymetru. Zmierzyć intensywność fluorescencji ekstraktów A i B.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość tiaminy w próbce, w mg/kg, obliczyć według wzoru:

   d x b

-------------,

(a - b) x c

w którym:

a -  intensywność fluorescencji ekstraktu A (wzorzec wewnętrzny);

b -  intensywność fluorescencji ekstraktu B (próbka);

c -  odważka próbki analitycznej, w g;

d -  ilość tiaminy, w µg, dodana do próbki analitycznej (wzorzec wewnętrzny).

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać:

-   10% wartości względnej, przy zawartościach poniżej 500 mg/kg,

-   5% wartości względnej, przy zawartościach równych lub wyższych od 500 mg/kg.

5.5. OZNACZANIE KWASU ASKORBINOWEGO I DEHYDROASKORBINOWEGO (WITAMINA C)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania całkowitej zawartości kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego (witamina C) w paszach, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 5 mg/kg. Ze względu na przewidywaną zawartość witaminy C produkty dzielone są na dwie grupy:

-   grupa A: zawartość witaminy poniżej 10 g/kg,

-   grupa B: zawartość witaminy równa lub wyższa od 10 g/kg.

2. ZASADA METODY

Zawiesina próbki w rozcieńczonym kwasie metafosforowym jest ekstrahowana chloroformem. W celu przeprowadzenia kwasu askorbinowego w kwas dehydroaskorbinowy faza wodna jest poddawana działaniu roztworu 2,6-dichlorofenyloindofenolu, a następnie roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny. Utworzony hydrazon jest ekstrahowany mieszaniną octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego i acetonu. Roztwór poddawany jest chromatografii na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym, eluat odparowuje się do sucha i pozostałość rozpuszcza w rozcieńczonym kwasie siarkowym. Absorbancję roztworu mierzy się spektrofotometrycznie przy 509 nm. W przypadku produktów z grupy A eluat po chromatografii kolumnowej jest poddawany chromatografii cienkowarstwowej celem izolacji hydrazonu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Roztwór wzorcowy kwasu askorbinowego o stężeniu 0,05%. Rozpuścić 50 mg kwasu L-askorbinowego w około 20 ml roztworu kwasu metafosforowego (3.2) i dopełnić do objętości 100 ml wodą. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.2. Roztwór kwasu metafosforowego o stężeniu 10% (w/v): Po rozdrobnieniu w moździerzu rozpuścić 200 g kwasu metafosforowego w wodzie i uzupełnić wodą do 2.000 ml. Przechowywać w temperaturze 4°C. Roztwór jest stabilny przez tydzień.

3.3. Chloroform

3.4. Roztwór 0,5% (w/v) 2,6-dichlorofenyloindofenolu o stężeniu 0,5% (w/v). Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.5. Materiał filtracyjny (S & S No 121 lub podobny)

3.6. Kwaśny roztwór 2,4-dinitrofenylohydrazyny o stężeniu 2% (w/v). Rozpuścić 2 g 2,4-dinitrofenylohydrazyny w 100 ml rozcieńczonego kwasu siarkowego (25 ml kwasu siarkowego, d = 1,84, rozcieńczyć do 100 ml wodą). Przechowywać w chłodnym miejscu nie dłużej niż tydzień.

3.7. Azot

3.8. Ditlenek węgla

3.9. Mieszanina octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego i acetonu w proporcjach objętościowych 96 : 2 : 2

3.10. Mieszanina dichlorometanu i lodowatego kwasu octowego w stosunku objętościowym 97 : 3

3.11. Żel krzemionkowy, rozmiar cząsteczek: od 0,05 do 0,2 mm

3.12. Żel krzemionkowy H do chromatografii cienkowarstwowej według Stahla

3.13. Rozcieńczony kwas siarkowy: wlać 105 ml wody do kolby miarowej o pojemności 200 ml. Uzupełnić do kreski kwasem siarkowym, d =1,84 g/ml

3.14. Roztwór eluujący do chromatografii cienkowarstwowej: zmieszać 75 ml eteru dietylowego cz.d.a., 25 ml octanu etylowego i 4 ml 96% (w/v) kwasu octowego. Po 2 lub 3 rozdziałach chromatograficznych roztwór sporządzić ponownie.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Łaźnia wodna z termostatem ustawiona na temperaturę 20°C

4.2. Wirówka (3.500 obr/min) z probówkami zaopatrzonymi w szklane korki, o pojemności od 40 do 50 ml

4.3. Obrotowy odparowywacz próżniowy z kolbami na 250 ml

4.4. Szklana kolumna chromatograficzna (długość 100 mm, średnica wewnętrzna 20 mm) z poziomym spiekiem (np. kolumny Allihn)

4.5. Spektrofotometr lub kolorymetr z kuwetami o 10 mm drodze światła

4.6. Aparatura do chromatografii cienkowarstwowej z płytkami pokrytymi 0,5-0,6 mm warstwą żelu krzemionkowego (3.12) (dostępne są gotowe płytki). Płytki suszyć przez 2,5 do 3 godzin w suszarce w temperaturze 120 - 130°C. Schłodzić, a następnie przechowywać w eksykatorze przynajmniej przez 24 godziny przed użyciem.

4.7. Suszarka nastawiona na temperaturę 120 - 130°C

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja

Umieścić w każdej z dwóch kolb miarowych A i B, o pojemności 250 ml (wyposażonych w szklane korki), jednakowe ilości dokładnie rozdrobnionej próbki, zawierające po około 200 µg witaminy C. Dodać tylko do kolby A 0,4 ml roztworu wzorcowego (3.1) i mieszać, delikatnie wstrząsając (wzorzec wewnętrzny).

Do obu kolb dodać po 30 ml chloroformu (3.3) i po 25 ml roztworu kwasu metafosforowego (3.2) w temperaturze 4°C. Wstrząsnąć krótko i pozostawić na 10 do 15 minut. Dodać 25 ml wody, założyć korki, wstrząsać przez 10 sekund i pozostawić na 10 do 15 minut na łaźni wodnej (4.1). Odwirować do rozdzielenia fazy wodnej od chloroformowej. Dalsze czynności przeprowadzać, jak opisano poniżej, równocześnie na wodnych ekstraktach A (wzorzec wewnętrzny) i B.

5.2. Utlenianie

Przenieść pipetą 40 ml wodnego roztworu (lekko mętnego), otrzymanego jak podano w (5.1), do probówki reakcyjnej ze szklanym korkiem, dodać 0,5 do 1 ml roztworu 2,6-dichlorofenyloindofenolu (3.4) i wymieszać. Powstała czerwona barwa powinna się utrzymywać co najmniej przez 15 minut. Następnie dodać około 300 mg materiału filtracyjnego (3.5), wstrząsnąć i przesączyć przez suchy sączek. Przesącz nie musi być klarowny.

5.3. Reakcja z 2,4-dinitrofenylohydrazyną i ekstrakcja hydrazonu

Przenieść pipetą 10 ml przesączu otrzymanego w (5.2) do probówki wirówkowej (4.2), dodać 2 ml roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny (3.6) i wymieszać. Do probówki skierować strumień azotu (3.7) lub ditlenku węgla (3.8), szybko zamknąć korkiem i umieścić na około 15 godzin (na noc) w łaźni wodnej (4.1).

Następnie dodać 3 ml wody, 20 ml mieszaniny octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego i acetonu (3.9) i około 800 mg materiału filtracyjnego. Zamknąć probówkę i energicznie wstrząsnąć przez 30 sekund i odwirować. Przenieść 15 ml roztworu znad osadu do kolby i odparować pod obniżonym ciśnieniem na obrotowym odparowywaczu próżniowym (4.3) aż do uzyskania oleistej pozostałości. Pozostałość rozpuścić w 2 ml mieszaniny octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego i acetonu (3.9), podgrzewając do temperatury 50°C, pozostawić do ochłodzenia i dodać 10 ml mieszaniny dichlorometanu i lodowatego kwasu octowego (3.10) i wymieszać.

5.4. Chromatografia kolumnowa

Napełnić kolumnę chromatograficzną (4.4) do wysokości około 30 mm mieszaniną dichlorometanu i lodowatego kwasu octowego (3.10). Utworzyć zawiesinę, energicznie wstrząsając, z 5 g żelu krzemionkowego (3.11) w 30 ml mieszaniny dichlorometanu i lodowatego kwasu octowego (3.10). Zawiesinę wlać do kolumny. Pozostawić do ustabilizowania się układu, a następnie upakować azotem (3.7) pod niskim ciśnieniem. Zdekantować do kolumny roztwór otrzymany w (5.3), przemyć kolbę małą ilością mieszaniny dichlorometanu i lodowatego kwasu octowego (3.10) i wlać do kolumny, po raz drugi wprowadzić do kolumny mieszaninę (3.10) i wymywać tą samą mieszaniną (3- lub 4-krotnie po 5 ml) aż do otrzymania barwnego eluatu. Odrzucić partię eluatu zabarwioną na żółto.

Wymywać czerwony obszar z górnej strefy kolumny mieszaniną octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego, acetonu (3.9), zebrać eluat i odparować do sucha.

5.4.1. Dla produktów z grupy A (zawartość witaminy C poniżej 10 g/kg)

Rozpuścić pozostałość w 2,0 ml mieszaniny octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego, acetonu (3.9) i natychmiast przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową, tak jak podano w (5.5).

5.4.2. Dla produktów z grupy B (zawartość witaminy C równa lub wyższa od 10 g/kg)

Oleistą pozostałość zalać 4 ml rozcieńczonego kwasu siarkowego (3.13), energicznie wstrząsnąć do całkowitego rozpuszczenia. Zmierzyć absorbancję jak w (5.6).

5.5. Chromatografia cienkowarstwowa

Czynności opisane poniżej przeprowadzić dwukrotnie. Nanieść na płytkę (4.6) w formie cienkiej linii 0,5 ml roztworu otrzymanego w (5.4.1). Przy użyciu roztworu eluującego (3.14) rozwijać chromatogram przez 20 minut w komorze wysyconej parami rozpuszczalnika aż do wyraźnego oddzielenia różowej strefy hydrazonu. Pozostawić w otwartej komorze do wyschnięcia. Zaznaczyć granice różowej strefy, następnie zeskrobać różowy pasek i przenieść ilościowo na kolumnę chromatograficzną (4.4).

Eluować kolejno, raz stosując 2 ml i dwa razy 1,5 ml mieszaniny octanu etylowego, lodowatego kwasu octowego i acetonu (3.9). Eluat zebrać do małej kolby (ostatni wyciek musi być bezbarwny). Odparować do sucha, następnie oleistą pozostałość zalać 4 ml rozcieńczonego kwasu siarkowego (3.13), wstrząsnąć energicznie do całkowitego rozpuszczenia osadu i zmierzyć absorbancję.

5.6. Pomiar absorbancji

Zmierzyć absorbancję przy użyciu spektrofotometru przy 509 nm, 20 do 30 minut po rozpuszczeniu pozostałości w kwasie siarkowym. Przeprowadzić pomiary w odniesieniu do roztworu kwasu siarkowego (3.13).

5.7. Ślepa próba

Stosując tę samą procedurę, przeprowadzić ślepą próbę.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość witaminy C w próbce, w g/kg, obliczyć według następującego wzoru:

   (c - a)x 2

-----------------,

(b - c) x 10 x d

gdzie:

a - absorbancja ślepej próby,

b - absorbancja roztworu wzorca wewnętrznego,

c - absorbancja roztworu próbki,

d - odważka badanej próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może być większa od:

-   10% wartości względnej, przy zawartościach witaminy C poniżej 10 g/kg;

-   5% wartości względnej, przy zawartościach witaminy C równych lub większych od 10 g/kg.

Rozdział 6

BADANIE STYMULATORÓW WZROSTU

6.1. OZNACZANIE WIRGINIAMYCYNY METODĄ DYFUZJI W ŻELU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania wirginiamycyny w paszach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg/kg (2 ppm)⁶⁾.

2. ZASADA METODY

Po ekstrakcji próbki metanolowym roztworem Tween 80, zdekantowaniu lub odwirowaniu i rozcieńczeniu oznaczana jest aktywność antybiotyczna ekstraktu przez pomiar dyfuzji wirginiamycyny w żelu agarowym zaszczepionym Micrococcus luteus. Dyfuzja jest widoczna w postaci stref zahamowania wzrostu mikroorganizmu. Średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Przygotowanie szczepu testowego

Przeszczepić na skos agarowy w probówce, otrzymany według (4.1), szczep testowy Micrococcus luteus i inkubować przez 24 godziny przy temperaturze 30°C. Przechowywać kulturę bakteryjną w lodówce przy temperaturze 4°C. Przeszczepiać na nowy skos agarowy co dwa tygodnie.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej

⁷⁾Skos agarowy ze świeżo wyhodowanym szczepem (3.1) zmyć za pomocą 2 do 3 ml roztworu chlorku sodu (4.3). Uzyskaną suspensją zaszczepić 250 ml roztworu podłoża (4.1) w butelce Roux i inkubować przez 18 do 20 godzin przy temperaturze 30°C. Po okresie inkubacji hodowlę zmyć przy użyciu 25 ml roztworu chlorku sodu (4.3) i zamieszać. Rozcieńczyć suspensję w stosunku 1:10 roztworem chlorku sodu (4.3).

Transmisja światła przez suspensję, mierzona przy 650 nm w 1 cm kuwetach w stosunku do roztworu chlorku sodu (4.3), powinna wynosić 75%. Suspensja może być przechowywana przez 1 tydzień przy temperaturze 4°C.

4. PODŁOŻA I ODCZYNNIKI

4.1. Podłoże do hodowli i oznaczania⁸⁾

Pepton                            6,0 g

Trypton                           4,0 g

Ekstrakt drożdżowy                3,0 g

Ekstrakt mięsny                   1,5 g

Glukoza                           1,0 g

Agar                              10,0 do 20,0 g

Woda                              1.000 ml

pH                                6,5 (po sterylizacji).

4.2 Bufor fosforanowy, pH 6

Wodorofosforan(V) dipotasu K₂HPO₄ - 2,0 g

Diwodorofosforan(V) potasu KH₂PO₄ - 8,0 g

Woda                              do 1.000 ml.

4.3. Chlorek sodu, roztwór 0,8% (w/v): rozpuścić 8 g chlorku sodu w wodzie i rozcieńczyć do 1.000 ml. Sterylizować.

4.4. Metanol

4.5. Mieszanina buforu fosforanowego (4.2) i metanolu (4.4): 80/20 (V/V)

4.6. Tween 80, metanolowy roztwór 0,5% (m/V): rozpuścić 5 g Tween 80 w metanolu (4.4) i rozcieńczyć metanolem do 1.000 ml.

4.7. Substancja wzorcowa: wirginiamycyna o znanej aktywności.

5. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji wzorcowej (4.7) w metanolu (4.4) i rozcieńczyć metanolem (4.4) do uzyskania roztworu podstawowego zawierającego 1.000 µg wirginiamycyny w 1 ml.

Przechowywany w szczelnie zamkniętej kolbie przy temperaturze 4°C, roztwór zachowuje stabilność do pięciu dni.

Z tego roztworu przygotować, metodą kolejnych rozcieńczeń przy użyciu mieszaniny (4.5), następujące roztwory:

S₈       1 µg/ml

S₄       0,5 µg/ml

S₂       0,25 µg/ml

S₁       0,125 µg/ml.

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU I ROZTWORÓW DO OZNACZANIA

6.1. Ekstrakcja

6.1.1. Produkty o zawartości wirginiamycyny do 100 mg/kg

Odważyć 50 g próbki, dodać 200 ml roztworu (4.6) i wstrząsać przez 30 minut. Pozostawić w celu sklarowania lub odwirować, pobrać 20 ml klarownego ekstraktu i odparować do około 5 ml w odparowywaczu obrotowym przy temperaturze nieprzekraczającej 40°C. Rozcieńczyć pozostałość w mieszaninie (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości wirginiamycyny 1 µg/ml (= U₈).

6.1.2. Produkty o zawartości wirginiamycyny wyższej niż 100 mg/kg

Odważyć część próbki o masie nie większej niż 10 g i zawierającej od 1 do 50 mg wirginiamycyny, dodać 100 ml roztworu (4.6) i wstrząsać przez 30 minut. Pozostawić w celu sklarowania lub odwirować, następnie rozcieńczyć klarowny ekstrakt mieszaniną (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości wirginiamycyny 1 µg/ml (= U₈).

6.2. Roztwory do badań

Z roztworu U₈ przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość 0,5 µg/ml), U₂ (oczekiwana zawartość 0,25 µg/ml), U₁ (oczekiwana zawartość 0,125 µg/ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu mieszaniny (4.5).

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Zaszczepianie podłoża do badań

Zaszczepić podłoże do badań (4.1) zawiesiną bakteryjną (3.2) przy temeraturze około 50°C. Poprzez przeprowadzenie wstępnych prób na płytkach przy użyciu podłoża (4.1) określić ilość zawiesiny bakteryjnej, przy której występują największe i wyraźne strefy zahamowania dla różnych stężeń wirginiamycyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest prowadzona na płytkach przy czterech stężeniach roztworów wzorcowych (S₈, 8₄, S₂, S₁) i czterech stężeniach roztworów badanych (U₈, U₄, U₂, U₁). Po cztery stężenia wzorca i roztworów badanych muszą być umieszczone na każdej płytce. Aby to uzyskać, należy wybrać płytki o takich rozmiarach, aby można było w agarze wyciąć 8 studzienek o średnicy od 10 do 13 mm i o odległości pomiędzy środkami studzienek nie mniejszej niż 30 mm. Badania mogą być prowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką ilość podłoża (4.1), zaszczepionego zgodnie z postępowaniem podanym w (7.1), aby otrzymać warstwę o grubości 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm).

Pozostawić w pozycji poziomej, wyciąć studzienki i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów badanych i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na studzienkę, w zależności od średnicy).

Nanieść każde stężenie co najmniej czterokrotnie; w ten sposób każde oznaczenie odpowiada pomiarowi 32 stref zahamowania.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16 do 18 godzin w temperaturze 30°C ± 2°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnicę stref zahamowania z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść średnią z czterech pomiarów dla każdego stężenia na papier o skali półlogarytmicznej w układzie: stężenie na skali półlogarytmicznej - średnica stref zahamowania na skali arytmetycznej. Wykreślić przez uśrednione linie dla roztworów wzorcowych i badanych, według poniższego przykładu.

Określić uśrednioną wartość wielkości stref zahamowania dla najniższego stężenia wzorca (SL) według wzoru:

        7 S₁ + 4 S₂ + S₄ - 2 S₈

(a) SL = -----------------------

                  10

Określić uśrednioną wartość wielkości stref zahamowania dla najwyższego stężenia wzorca (SH) według wzoru:

        7 S₈ + 4 S₄ + S₂ ± 2 S₁

(b) SH = ------------------------

                  10

Podobnie obliczyć uśrednione wartości wielkości stref zahamowania dla najniższego stężenia badanego ekstraktu (UL) i stężenia najwyższego (UH), zastępując S₁, S₂, S₄, S₈ - U₁, U₂, U₄, U₈ w powyższych wzorach.

Nanieść obliczone wartości SL i SH na ten sam papier, połączyć punkty i wykreślić prostą dla roztworu wzorcowego. Podobnie nanieść wartości UL i UH i wykreślić prostą dla roztworu badanego.

W przypadku braku interferencji proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeżeli wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10% od ich średniej wartości.

Jeżeli proste nie spełniają warunku równoległości, U₁ i S₁ lub U₈ i S₈ mogą być odrzucone, a SL, SH, UL i UH obliczone z alternatywnych wzorów, dając alternatywne "uśrednione linie":

         5 S₁ + 2 S₂ - S₄      5 S₂ + 2 S₄ - S₈

(a’) SL = ----------------- lub ------------------,

                6                      6

         5 S₄ + 2 S₂ - S₁      5 S₈ + 2 S₄-S₂

(b’) SH = ----------------- lub ---------------

               6                      6

i podobnie dla UL i UH. To samo kryterium równoległości powinno być zastosowane. Obliczone wyniki na podstawie 3 punktów należy odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste spełniają warunek równoległości, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) na podstawie jednego z poniższych wzorów, w zależności od liczby punktów, według których oceniano równoległość.

Dla 4 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈)x 0,602

(c) log A = -----------------------------------------------,

              U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁- S₂

Dla 3 punktów

            (U₁ + U₂ + U₄ - S₁ - S₂ - S₄) x 0,401

(d) log A = ---------------------------------------,

                      U₄ + S₄ - U₁ - S₁

lub

           (U₂ + U₄ + U₈ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,401

(d’) log A = --------------------------------------

                      U₈ + S₈ - U₂ - S₂

Aktywność ekstraktu próbki = aktywność stosownego wzorca x A

U₈ = S₈ x A

Jeżeli względna aktywność nie mieści się w przedziale od 0,5 do 2,0, należy powtórzyć oznaczanie, wprowadzając odpowiednią korektę stężenia ekstraktów lub, jeżeli nie jest to możliwe, roztworów wzorcowych. Gdy względna aktywność nie mieści się nadal w wymaganym przedziale, uzyskane wyniki należy traktować jako przybliżone i odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste nie spełniają warunku równoległości, należy powtórzyć oznaczenie. Jeżeli warunek równoległości nie jest nadal spełniany, nie będzie uzyskany zadowalający wynik oznaczenia. Wyrazić wynik w mg wirginiamycyny na kg paszy.

9. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez jednego analityka nie może przekraczać:

-   2 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości wirginiamycyny do 10 mg/kg;

-   20% wartości wyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg;

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 25 do 50 mg/kg;

-   10% wartości wyższego wyniku dla zawartości ponad 50 mg/kg.

6.2. OZNACZANIE ZN-BACYTRACYNY METODĄ DYFUZJI W ŻELU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania Zn-bacytracyny w paszach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 5 mg/kg (5 ppm)⁹⁾.

2. ZASADA METODY

Próbka jest poddawana ekstrakcji mieszaniną metanol / woda / kwas solny o pH 2 z dodatkiem roztworu siarczku sodowego. Siarczek sodowy służy do strącania rozpuszczalnych soli miedzi, które mogą interferować przy oznaczaniu. Ekstrakt jest doprowadzany do pH 6,5, zatężany (jeśli to konieczne) lub rozcieńczany. Aktywność antybiotyczna ekstraktu jest oznaczana przez pomiar dyfuzji Zn-bacytracyny w żelu agarowym zaszczepionym Micrococcus luteus (flavus). Dyfuzja jest widoczna w postaci stref zahamowania mikroorganizmu. Średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: Micrococcus luteus ATCC 10240

3.1. Przygotowanie szczepu testowego

Przeszczepić na skos agarowy w probówce, otrzymany według (4.1), mikroorganizm Micrococcus luteus (flavus) i inkubować przez 24 godziny przy temperaturze 30°C. Przechowywać kulturę bakteryjną w lodówce przy temperaturze 4°C. Przeszczepiać na nowy skos agarowy co dwa tygodnie.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej⁷⁾

Skos agarowy ze świeżo wyhodowanym szczepem (3.1) zmyć za pomocą 2 do 3 ml roztworu chlorku sodu (4.3). Uzyskaną suspensją zaszczepić 250 ml roztworu podłoża (4.1) w butelce Roux i inkubować przez 18 do 20 godzin przy temperaturze 30°C. Po okresie inkubacji hodowlę zmyć 25 ml roztworu chlorku sodu (4.3) i zamieszać. Rozcieńczyć suspensję w stosunku 1 : 10 przy użyciu roztworu chlorku sodu (4.3).

Transmisja światła przez suspensję, mierzona przy 650 nm w 1 cm kuwetach w stosunku do roztworu chlorku sodu (4.3), powinna wynosić 75%. Suspensja może być przechowywana przez 1 tydzień przy temperaturze 4°C.

4. PODŁOŻA I ODCZYNNIKI

4.1. Podłoże do hodowli⁸⁾

Pepton                6,0 g

Trypton               4,0 g

Ekstrakt drożdżowy    3,0 g

Ekstrakt mięsny       1,5 g

Glukoza               1,0 g

Agar                  10,0 do 20,0 g

Woda                  1.000 ml

pH                    6,5 do 6,6 (po sterylizacji).

4.2. Podłoże do oznaczania⁸⁾

Trypton               10,0 g

Ekstrakt drożdżowy    3,0 g

Ekstrakt mięsny       1,5 g

Glukoza               1,0 g

Agar                  10,0 do 20,0 g

Tween 80              1 ml

Woda                  1.000 ml

pH                    6,5 (po sterylizacji).

4.3. Chlorek sodu, roztwór 0,8% (m/V): rozpuścić 8 g chlorku sodu w wodzie i rozcieńczyć do 1.000 ml. Sterylizować.

4.4. Mieszanina: metanol cz. / woda / kwas chlorowodorowy (4.6): 80/17,5/2,5 (V/V/V)

4.5. Bufor fosforanowy, pH 6,5

Wodorofosforan(V) dipotasu K₂HPO₄        22,15 g

Diwodorofosforan(V) potasu KH₂PO₄        27,85 g

Woda do                                  1.000 ml.

4.6. Kwas chlorowodorowy (d = 1,18 do 1,19 g/ml)

4.7. Kwas chlorowodorowy, roztwór (0,1 M)

4.8. Wodorotlenek sodu, roztwór 1 M

4.9. Siarczek sodu, roztwór w przybliżeniu 0,5 M

4.10. Purpura bromokrezolowa, roztwór 0,04% (m/V): rozpuścić 0,1 g purpury bromokrezolowej w 18,5 ml wodorotlenku sodu o stężeniu 0,01 M. Dopełnić do 250 ml wodą i zamieszać.

4.11. Substancja wzorcowa: Zn-bacytracyna o znanej aktywności (w i.u.)

5. ROZTWORY WZORCOWE

Odważyć taką ilość wzorca Zn-bacytracyny (4.11), która odpowiada aktywności równej 1.050 i.u. Dodać 5 ml 0,1 M kwasu solnego (4.7) i pozostawić na 15 min. Dodać 30 ml wody, doprowadzić do pH 4,5 przy użyciu buforu fosforanowego o pH 6,5 (4.5) (około 4 ml), dopełnić do objętości 50 ml wodą i dobrze zamieszać (1 ml = 21 i.u.).

Z tego roztworu przygotować, metodą kolejnych rozcieńczeń przy użyciu buforu fosforanowego o pH 6,5 (4.5), następujące roztwory:

S₈       0,42 i.u./ml

S₄       0,21 i.u./ml

S₂       0,105 i.u./ml

S₁       0,0525 i.u./ml.

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU I ROZTWORÓW DO OZNACZANIA

6.1. Ekstrakcja

6.1.1. Premiksy i pasze mineralne

Odważyć od 2,0 do 5,0 g próbki, dodać 29,0 ml mieszaniny (4.4), 1 ml roztworu siarczku sodu (4.9) i krótko wstrząsnąć. Sprawdzić, czy pH wynosi około 2. Wstrząsać przez 10 min, dodać 30 ml buforu fosforanowego (4.5), ponownie wstrząsać przez 15 min i odwirować. Pobrać odpowiednią ilość klarownego ekstraktu i doprowadzić pH do 6,5 roztworem wodorotlenku sodu 1 M (4.8), sprawdzając przy użyciu pehametru lub wobec roztworu purpury bromokrezolowej (4.10) jako wskaźnika. Rozcieńczyć buforem fosforanowym (4.5), aby otrzymać oczekiwaną zawartość Zn-bacytracyny 0,42 i.u./ml (= U₈).

6.1.2. Koncentraty białkowe

Odważyć próbkę o masie 10,0 g, dodać 49,0 ml mieszaniny (4.4), 1 ml roztworu siarczku sodu (4.9) i krótko wstrząsać. Sprawdzić, czy pH wynosi około 2. Wstrząsać przez 10 min. Dodać 50 ml buforu fosforanowego (4.5), wstrząsać przez 15 minut i odwirować. Pobrać odpowiednią ilość klarownego ekstraktu i doprowadzić pH do 6,5 roztworem wodorotlenku sodowego 1 M (4.8), sprawdzając przy użyciu pehametru lub wobec roztworu purpury bromokrezolowej (4.10) jako wskaźnika. Odparować do połowy objętości na odparowywaczu próżniowym w temperaturze nie wyższej niż 35°C. Rozcieńczyć buforem fosforanowym (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości Zn-bacytracyny 0,42 i.u./ml (= U₈).

6.1.3. Pasze pozostałe

Odważyć 10 g próbki (20,0 g dla zawartości Zn-bacytracyny 5 mg/kg). Dodać 24 ml mieszaniny (4.4), 1 ml roztworu siarczku sodu (4.9) i homogenizować przez 10 min. Dodać 25 ml buforu fosforanowego (4.5), wstrząsać przez 15 min i odwirować. Przenieść 20 ml klarownego ekstraktu i doprowadzić do pH 6,5 przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu 1 M (4.8) w obecności purpury bromokrezolowej (4.9) jako wskaźnika. Odparować do około 4 ml na odparowywaczu próżniowym przy temperaturze nieprzekraczającej 35°C. Rozcieńczyć pozostałość buforem fosforanowym (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości Zn-bacytracyny 0,42 i.u./ml (= U₈).

6.2. Roztwory do badań

Z roztworu U₈ przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość 0,21 i.u./ml), U₂ (oczekiwana zawartość 0,105 i.u./ml), U₁ (oczekiwana zawartość 0,0525 i.u./ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu buforu fosforanowego (4.5).

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Zaszczepianie podłoża do badań

Zaszczepić podłoże do badań (4.2) zawiesiną bakteryjną (3.2) przy temperaturze około 50°C. Poprzez przeprowadzenie wstępnych prób na płytkach przy użyciu pożywki do badań (4.2) określić ilość zawiesiny bakteryjnej, przy której występują największe i wyraźne strefy zahamowania dla różnych stężeń Zn-bacytracyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest prowadzona na płytkach przy czterech stężeniach roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) i czterech stężeniach roztworów badanych (U₈, U₄, U₂, U₁₎. Po cztery stężenia wzorca i roztworów badanych muszą być umieszczone na każdej płytce. Aby to uzyskać, należy wybrać płytki o takich rozmiarach, aby można było w agarze wyciąć 8 studzienek o średnicy od 10 do 13 mm i o odległości pomiędzy środkami studzienek nie mniejszej niż 30 mm. Badania mogą być prowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką ilość podłoża (4.2), zaszczepionego według (7.1), aby otrzymać warstwę o grubości 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić w pozycji poziomej, wyciąć studzienki i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów badanych i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na studzienkę, w zależności od średnicy).

Nanieść każde stężenie co najmniej czterokrotnie; w ten sposób każde oznaczenie odpowiada pomiarowi 32 stref zahamowania.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16 do 18 godzin w temperaturze 30°C ± 2°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnicę stref zahamowania z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papier o skali półlogarytmicznej w układzie: stężenie na skali półlogarytmicznej - średnica stref zahamowania na skali arytmetycznej. Wykreślić przez uzyskane uśrednione punkty linie dla roztworów wzorcowych i badanych według poniższego przykładu. Określić "uśredniony punkt" dla najniższego stężenia wzorca (SL) według wzoru:

        7 S₁ + 4 S₂ + S₄ - 2 S₈

(a) SL = ------------------------

                 10

Określić uśrednioną wartość wielkości stref zahamowania dla najwyższego stężenia wzorca (SH) według wzoru:

        7 S₈ + 4 S₄ + S₂ - 2 S₁

(b) SH = ------------------------

                  10

Podobnie obliczyć uśrednione wartości wielkości stref zahamowania dla najniższego stężenia badanego ekstraktu (UL) i stężenia najwyższego (UH), zastępując S₁, S₂, S₄, S₈ - U₁ U₂, U₄, U₈ w powyższych wzorach.

Nanieść obliczone wartości SL i SH na ten sam papier, połączyć punkty i wykreślić prostą dla roztworu wzorcowego. Podobnie nanieść wartości UL i UH i wykreślić prostą dla roztworu badanego.

W przypadku braku interferencji proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeżeli wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10% od ich średniej wartości.

Jeżeli proste nie spełniają warunku równoległości, U₁ i S₁ lub U₈ i S₈ mogą być odrzucone, a SL, SH, UL i UH obliczone z alternatywnych wzorów, dając alternatywne "uśrednione linie".

         5 S₁ + 2 S₂ - S₄      5 S₂ + 2 S₄ - S₈

(a’) SL = ----------------- lub -----------------,

                6                      6

         5 S₄ + 2 S₂ - S₁      5 S₈ + 2 S₄ - S₂

(b’) SH = ----------------- lub ------------------

                6                     6

i podobnie dla UL i UH. To samo kryterium równoległości powinno być zastosowane. Wyniki obliczone na podstawie 3 punktów należy odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste spełniają warunek równoległości, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) na podstawie jednego z poniższych wzorów, w zależności od liczby punktów, według których oceniano równoległość.

Dla 4 punktów

            (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

(c) log A = --------------------------------------------------,

                 U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Dla 3 punktów

         (U₁ + U₂ + U₄ - S₁ - S₂ - S₄) x 0,401

(d) log A = ---------------------------------------

                    U₄ + S₄ - U₁ - S₁

lub

            (U₂ + U₄ + U₈ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,401

(d’) log A = ---------------------------------------

                     U₈ + S₈ - U₂ - S₂

Aktywność ekstraktu próbki = aktywność stosownego wzorca x A

U₈ = S₈ x A

Jeżeli względna aktywność nie mieści się w przedziale od 0,5 do 2,0, należy powtórzyć oznaczenie, wprowadzając odpowiednią korektę stężenia ekstraktów lub, jeżeli nie jest to możliwe, roztworów wzorcowych. Gdy względna aktywność nie mieści się nadal w wymaganym przedziale, uzyskane wyniki należy traktować jako przybliżone i odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste nie spełniają warunku równoległości, należy powtórzyć oznaczenie. Jeżeli warunek równoległości nie jest nadal spełniany, nie będzie uzyskany zadowalający wynik oznaczenia. Wyrazić wynik w mg Zn-bacytracyny na kg paszy.

9. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez jednego analityka nie może przekraczać:

-   2 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości Zn-bacytracyny do 10 mg/kg;

-   20% wartości wyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg;

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 25 do 50 mg/kg;

-   10% wartości wyższego wyniku dla zawartości ponad 50 mg/kg.

6.3. OZNACZANIE FLAWOMYCYNY METODĄ DYFUZJI W ŻELU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania flawomycyny w mieszankach paszowych, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 1 mg/kg (1 ppm).

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowana rozcieńczonym metanolem na gorąco pod chłodnicą zwrotną. Po odwirowaniu ekstrakt zostaje oczyszczony (gdy jest to konieczne) na żywicy jonowymiennej i rozcieńczony. Aktywność antybiotyczna ekstraktu jest oznaczana przez pomiar dyfuzji flawomycyny w żelu agarowym zaszczepionym Staphylococcus aureus. Dyfuzja jest widoczna w postaci stref zahamowania mikroorganizmu. Średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: Staphylococcus aureus ATCC 6538 P

3.1. Przygotowanie szczepu testowego

Przeszczepić Staphylococcus aureus na skosy agarowe sporządzone z podłoża do hodowli (4.1). Inkubować przez 24 godziny przy temperaturze 37°C. Przechowywać w lodówce przy temperaturze 4°C i przeszczepiać co miesiąc na nowy skos agarowy.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej¹⁰⁾

Odstawić dwie probówki zawierające szczep testowy (3.1) i powtórnie przeszczepić w ciągu tygodnia. Inkubować przez 24 godziny przy temperaturze 37°C i przechowywać w lodówce przy temperaturze 4°C. Na 24 godziny przed oznaczaniem przenieść tę hodowlę do dwóch, a najwyżej czterech probówek zawierających skosy agarowe na podłożu (4.1). Inkubować przez 16 do 18 godzin przy temperaturze 37°C. Przygotować suspensję hodowli w roztworze chlorku sodu (4.3). Transmisja światła przez suspensję, mierzona przy 578 nm w 1 cm kuwetach w stosunku do roztworu chlorku sodu (4.3), powinna wynosić około 40%.

4. PODŁOŻA I ODCZYNNIKI

4.1. Podłoże do hodowli¹¹⁾

Pepton                  6,0 g

Trypton                 4,0 g

Ekstrakt drożdżowy      3,0 g

Ekstrakt mięsny         1,5 g

Glukoza                 1,0 g

Agar                    15,0 g

Woda                    1.000 ml

pH                      6,5 (po sterylizacji)

4.2. Podłoże do oznaczania

4.2.1. Warstwa dolna¹²⁾

Pepton                  6,0 g

Ekstrakt drożdżowy      3,0 g

Ekstrakt mięsny         1,5 g

Glukoza                 1,0 g

Agar                    10,0 g

Woda                    1.000 ml

pH                      6,5 (po sterylizacji)

4.2.2. Warstwa górna do posiewu

Sporządzić według (4.1) z dodatkiem 2,0 g emulsji silikonowej zapobiegającej pienieniu się.¹²⁾

4.3. Chlorek sodu, roztwór 0,4% (m/V): rozpuścić 4 g chlorku sodu w wodzie i rozcieńczyć do 1000 ml; sterylizować.

4.4. Metanol, czysty

4.5. Metanol, roztwór 50% (V/V): rozcieńczyć 500 ml metanolu (4.4) przy użyciu 500 ml wody.

4.6. Metanol, roztwór 80% (V/V): rozcieńczyć 800 ml metanolu (4.4) przy użyciu 200 ml wody.

4.7. Tris(hydroksymetylo)aminometan

4.8. Chlorek potasowy, roztwór metanolowy 1,5% (m/V): rozpuścić 1,5 g chlorku potasu w 20 ml wody, dopełnić do objętości 100 ml metanolem (4.4).

4.9. Żywica jonowymienna kationitowa: Dowex 50 W x 8, 20 do 50 mesh, forma sodowa (kat. Serva Nr 41600) lub podobna

4.10. Żywica jonowymienna anionitowa: Dowex 1 x 2, 50 do 100 mesh, forma chlorkowa (kat. Serva Nr 41010) lub podobna. Przed użyciem utrzymywać od 14 do 16 godzin w 80% metanolu (4.6).

4.11. Wata szklana

4.12. Papierek wskaźnikowy (pH 6,6 do 8,1)

4.13. Kwas askorbinowy

4.14. Substancja wzorcowa: flawomycyna o znanej aktywności

5. APARATURA I SPRZĘT

5.1. Kolumna chromatograficzna, średnica wewnętrzna: 9 mm, długość 150 do 200 mm, zakończona kranem na węższym, dolnym końcu i szlifem szklanym (w celu podłączenia wkraplacza (5.2)) w części górnej

5.2. Wkraplacz o pojemności 250 ml, z kranem i szlifem szklanym

5.3. Kolba stożkowa o pojemności 250 ml, ze szlifem szklanym

5.4. Chłodnica ze szlifem szklanym

6. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji wzorcowej (4.14) w 50% metanolu (4.5) i rozcieńczyć, uzyskując roztwór wzorcowy zawierający 100 µg flawomycyny w ml. Roztwór wzorcowy, przechowywany w zamkniętych kolbach w temperaturze 4°C, jest stabilny przez dwa miesiące.

Z tego roztworu przygotować metodą kolejnych rozcieńczeń przy użyciu 50% metanolu (4.5) następujące roztwory:

S₈       0,2 µg/ml

S₄       0,1 µg/ml

S₂       0,05 µg/ml

S₁       0,025 µg/ml

7. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

7.1. Ekstrakcja

7.1.1. Koncentraty, premiksy i pasze mineralne

Odważyć od 2,0 do 5,0 g próbki i dodać około 150 mg kwasu askorbinowego (4.13). Zhomogenizować przy użyciu 150 ml 50% metanolu (4.5) w kolbie stożkowej (5.3) i doprowadzić pH do 8,1 - 8,2, dodając około 400 mg tris(hydroksymetylo)aminometanu (4.7).

Sprawdzić pH papierkiem wskaźnikowym (4.12). Pozostawić na 15 minut, ponownie doprowadzić do pH 8,1 - 8,2 przy użyciu tris hydroksymetyloaminometanu (4.7) i gotować przez 10 minut pod chłodnicą zwrotną (5.4), stale mieszając. Pozostawić do schłodzenia, odwirować mieszaninę i zdekantować ekstrakt.

7.1.2. Pozostałe pasze

Odważyć od 5,0 do 30,0 g próbki zawierającej co najmniej 30 µg flawomycyny. Zhomogenizować przy użyciu 150 ml 50% metanolu (4.5) w kolbie stożkowej (5.3) i doprowadzić pH do 8,1 - 8,2, dodając około 400 mg tris(hydroksymetylo)aminometanu (4.7). Sprawdzić pH papierkiem wskaźnikowym (4.12). Pozostawić na 15 minut, ponownie doprowadzić do pH 8,1 - 8,2 przy użyciu tris(hydroksymetylo)aminometanu (4.7) i gotować przez 10 minut pod chłodnicą zwrotną (5.4), stale wstrząsając. Pozostawić do schłodzenia, odwirować mieszaninę i zdekantować ekstrakt.

7.2. Oczyszczanie (ten etap może być pominięty w przypadku analizy koncentratów, premiksów i pasz mineralnych)

Zmieszać 110 ml ekstraktu z 11 g żywicy jonowymiennej kationitowej (4.9), gotować przez 1 minutę pod chłodnicą zwrotną (5.4), stale mieszając. Oddzielić żywicę przez odwirowanie lub odsączenie. Zmieszać 100 ml ekstraktu z 150 ml metanolu (4.4) i przechowywać roztwór od 12 do 15 godzin przy temperaturze 4°C. Odsączyć osad na zimno.

Umieścić zwitek waty szklanej (4.11) na dole kolumny chromatograficznej (5.1), umieścić w kolumnie 5 ml żywicy jonowymiennej (4.10) i przemyć kolumnę, stosując 100 ml 80% metanolu (4.6). Przy użyciu wkraplacza (5.2) nanieść na kolumnę filtrat o objętości co najmniej 100 ml, zawierający przypuszczalnie 16 µg flawomycyny (200 ml dla 30 g próbki paszy o zawartości 1 ppm). W koniecznym przypadku, przed wprowadzeniem na kolumnę, rozcieńczyć filtrat 80% metanolem (4.6) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości flawomycyny 16 µg/100 ml. Ustawić przepływ na około 2 ml na minutę.

Odrzucić eluent. Następnie przemywać kolumnę przy użyciu 50 ml 80% metanolu (4.6) i ponownie odrzucić eluent. Eluować flawomycynę metanolowym roztworem chlorku potasu (4.8), utrzymując przepływ około 2 ml na minutę. Zebrać 50 ml eluatu w kolbie miarowej, dodać 30 ml wody i zamieszać. Zawartość flawomycyny w tym roztworze powinna wynosić 0,2 µg/ml (= U₈).

7.3. Roztwory do oznaczania

W koniecznym przypadku (tj. gdy etap oczyszczania jest pomijany) rozcieńczyć ekstrakt otrzymany według opisu w (7.1.1) przy użyciu 50% metanolu (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości flawomycyny 0,2 µg/ml (= U₈).

Z roztworu U₈ przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość: 0,1 µg/ml), U₂ (oczekiwana zawartość: 0,05 µg/ml) i U₁ (oczekiwana zawartość: 0,025 µg/ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu 50% metanolu (4.5).

8. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

8.1. Zaszczepienie pożywki do badań

Zaszczepić pożywkę do badań (4.2.2) zawiesiną bakteryjną (3.2) przy temperaturze około 50°C. Poprzez przeprowadzenie wstępnych prób na płytkach przy użyciu pożywki do badań (4.2.2) określić ilość zawiesiny bakteryjnej, przy której występują największe i wyraźne strefy zahamowania dla różnych stężeń flawomycyny (około 30 ml/l).

8.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest prowadzona na płytkach przy czterech stężeniach roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) i czterech stężeniach roztworów badanych (U₈, U₄, U₂, U₁). Po cztery stężenia wzorca i roztworów badanych muszą być umieszczone na każdej płytce. Aby to uzyskać, należy wybrać płytki o takich rozmiarach, aby można było w agarze wyciąć 8 studzienek o średnicy od 10 do 13 mm i o odległości pomiędzy środkami studzienek nie mniejszej niż 30 mm. Badania mogą być prowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką ilość pożywki (4.2.1), aby otrzymać warstwę o grubości 1,5 mm (45 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić w pozycji poziomej i nanieść górną warstwę z pożywki (4.2.2.), zaszczepioną według (8.1), o grubości 1 mm (30 ml na płytkę o średnicy 200 ml). Pozostawić w poziomej pozycji, wyciąć studzienki i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów badanych i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na studzienkę, w zależności od średnicy).

Nanieść każde stężenie co najmniej czterokrotnie; w ten sposób każde oznaczenie odpowiada pomiarowi 32 stref zahamowania.

8.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16 do 18 godzin przy temperaturze od 28 do 30°C.

9. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnicę stref zahamowania z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść średnią pomiarów dla każdego stężenia na papier o skali półlogarytmicznej w układzie: stężenie na skali półlogarytmicznej - średnica stref zahamowania na skali arytmetycznej. Wykreślić przez uzyskane "uśrednione punkty" linie dla roztworów wzorcowych i badanych według poniższego przykładu. Określić "uśredniony punkt" dla najniższego stężenia wzorca (SL) według wzoru:

         7 S₁ + 4 S₂ + S₄ - 2 S₈

(a) SL = -------------------------

                10

Określić uśrednioną wartość wielkości stref zahamowania dla najwyższego stężenia wzorca (SH) według wzoru:

         7 S₈ + 4 S₄ + S₂ - 2 S₁

(b) SH = -------------------------

                   10

Podobnie obliczyć uśrednione wartości wielkości stref zahamowania dla najniższego stężenia badanego ekstraktu (UL) i stężenia najwyższego (UH), zastępując S₁, S₂, S₄, S₈ - U₁, U₂, U₄, U₈ w powyższych wzorach.

Nanieść obliczone wartości SL i SH na ten sam papier i wykreślić prostą dla roztworu wzorcowego. Podobnie nanieść wartości UL i UH i wykreślić prostą dla roztworu badanego.

W przypadku braku interferencji proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeżeli wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10% od ich średniej wartości.

Jeżeli proste nie spełniają warunku równoległości, U₁ i S₁ lub U₈ i S₈ mogą być odrzucone, a SL, SH, UL i UH obliczone z alternatywnych wzorów, dając alternatywne "uśrednione linie".

         5 S₁ + 2 S₂ - S₄      5 S₂ + 2 S₄ - S₈

(a’) SL = ----------------- lub -----------------,

                6                   6

         5 S₄ + 2 S₂ - S₁      5 S₈ + 2 S₄ - S₂

(b’) SH = ----------------- lub ------------------

               6                     6

i podobnie dla UL i UH. To samo kryterium równoległości powinno być zastosowane. Obliczanie wyników na podstawie 3 punktów należy odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste spełniają warunek równoległości, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) na podstawie jednego z poniższych wzorów, w zależności od liczby punktów, według których oceniano równoległość.

Dla 4 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

(c) log A = ------------------------------------------------,

                U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Dla 3 punktów

            (U₁ + U₂ + U₄ - S₁ - S₂ - S₄) x 0,401

(d) log A = ---------------------------------------

                      U₄ + S₄ - U₁ - S₁

lub

            (U₂ + U₄ + U₈ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,401

(d’) log A = ---------------------------------------

                      U₈ + S₈ - U₂ - S₂

Rzeczywista aktywność = aktywność przypuszczalna x aktywność względna.

Gdy proste nie spełniają warunku równoległości, należy powtórzyć oznaczenie. Jeżeli warunek równoległości nie jest nadal spełniany, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) z wzoru (c). Otrzymany w ten sposób wynik należy uważać za przybliżony i odnotować to w końcowym raporcie.

10. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez jednego analityka nie może przekraczać:

-   0,5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości flawomycyny od 1 do 2 mg/kg,

-   25% wartości najwyższego wyniku dla zawartości od 2 do 10 mg/kg,

-   20% wartości najwyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg,

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 25 do 50 mg/kg,

-   10% wartości wyższego wyniku dla zawartości ponad 50 mg/kg.

6.4. OZNACZANIE SPIRAMYCYNY METODĄ DYFUZJI W ŻELU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania spiramycyny w paszach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 1 mg/kg (1 ppm¹³⁾).

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowaną mieszaniną metanolu i buforu fosforanowo-węglanowego o pH 8. Ekstrakt jest dekantowany lub odwirowywany, a następnie rozcieńczany. Aktywność antybiotyczna ekstraktu jest oznaczana przez pomiar dyfuzji spiramycyny w żelu agarowym zaszczepionym Micrococcus luteus. Dyfuzja jest widoczna w postaci stref zahamowania mikroorganizmu. Średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Przygotowanie szczepu testowego

Na skos agarowy otrzymany z podłoża do hodowli (4.1) przeszczepić Micrococcus luteus i inkubować przez 24 godziny przy temperaturze 30°C. Przechowywać kulturę bakteryjną w lodówce w temperaturze 4°C. Przeszczepiać co dwa tygodnie na świeży skos.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej⁷⁾

Zmyć hodowlę z ostatnio przygotowanego skosu agarowego (3.1) przy użyciu 2 do 3 ml roztworu chlorku sodu (4.3). Uzyskaną suspensją zaszczepić 250 ml roztworu podłoża (4.1) w butelce Roux i inkubować przez 18 do 20 godzin przy temperaturze 30°C. Po okresie inkubacji hodowlę zmyć 25 ml roztworu chlorku sodu (4.3) i zamieszać. Rozcieńczyć suspensję w stosunku 1 : 10 przy użyciu roztworu chlorku sodu (4.3).

Transmisja światła przez suspensję, mierzona przy 650 nm w 1 cm kuwetach w stosunku do roztworu chlorku sodu (4.3), powinna wynosić 75%. Suspensja może być przechowywana przez 1 tydzień przy temperaturze 4°C.

4. PODŁOŻA, ODCZYNNIKI I ROZTWORY

4.1. Podłoże do hodowli⁸⁾

Pepton                  6,0 g

Trypton                 4,0 g

Ekstrakt drożdżowy      3,0 g

Ekstrakt mięsny         1,5 g

Glukoza                 1,0 g

Agar                    10,0 do 20,0 g

Woda                    1.000 ml

pH                      6,5 do 6,6 (po sterylizacji).

4.2. Podłoże do oznaczania⁸⁾

Trypton                 5,0 g

Ekstrakt drożdżowy      4,0 g

Ekstrakt mięsny         3,0 g

Agar                    10,0 do 20,0 g

Woda                    1.000 ml

pH                      8,0 (po sterylizacji).

4.3. Chlorek sodu, roztwór 0,8% (m/V). Rozpuścić 8 g chlorku sodu w wodzie i rozcieńczyć do 1.000 ml. Sterylizować.

4.4. Bufor fosforanowo-węglanowy, pH 8,0:

-   Wodorofosforan(V) dipotasu K₂HPO₄  16,7 g

-   Diwodorofosforan(V) potasu KH₂PO₄  0,5 g

-   Wodorowęglan sodu NaHCO₃          20,0 g

-   Woda                              do 1.000 ml.

4.5. Mieszanina: metanol / bufor fosforanowo-węglanowy (4.4) 50/50 (V/V)

4.6. Substancja wzorcowa: spiramycyna o znanej aktywności (w IU)

5. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie zważoną ilość substancji wzorcowej (4.6) w mieszaninie (4.5) i rozcieńczyć tą samą mieszaniną do uzyskania roztworu podstawowego zawierającego 1.000 IU spiramycyny w 1 ml. Roztwór przechowywany w zamkniętej kolbie przy temperaturze 4°C zachowuje stabilność przez pięć dni.

Z tego roztworu przygotować, metodą kolejnych rozcieńczeń przy użyciu mieszaniny (4.5), następujące roztwory:

S₈       1 IU/ml

S₄       0,5 IU/ml

S₂       0,25 IU/ml

S₁       0,125 IU/ml.

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU I ROZTWORÓW DO OZNACZANIA

6.1. Ekstrakcja

Odważyć 20,0 g próbki w przypadku mieszanek paszowych i od 1,0 do 20,0 g w przypadku premiksów. Dodać 100 ml mieszaniny (4.5) i wstrząsać przez 30 minut. Odwirować lub zdekantować i rozcieńczyć roztwór supernatantu przy użyciu mieszaniny (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości spiramycyny 1 IU/ml (= U₈).

W przypadku spodziewanych zawartości spiramycyny niższych niż 2,5 mg/kg paszy przeprowadzić ekstrakcję w następujący sposób. Odważyć 20,0 g próbki. Dodać 100 ml mieszaniny (4.5) i wstrząsać przez 30 minut. Wirować przez kilka minut, pobrać 50 ml ekstraktu znad osadu i odparować do około 4 ml na odparowywaczu próżniowym w temperaturze nie wyższej niż 40°C. Rozcieńczyć pozostałość mieszaniną (4.5) w celu otrzymania oczekiwanej zawartości spiramycyny 1 IU/ml (= U₈).

6.2. Roztwory do badań

Z roztworu U₈ przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość 0,5 IU/ ml), U₂ (oczekiwana zawartość 0,25 IU/ ml) i U₁ (oczekiwana zawartość 0,125 IU/ ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu mieszaniny (4.5).

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Zaszczepienie pożywki do badań

Zaszczepić pożywkę do badań (4.2) zawiesiną bakteryjną (3.2) przy temperaturze około 50°C. Poprzez przeprowadzenie wstępnych prób na płytkach przy użyciu podłoża do badań (4.2) określić ilość zawiesiny bakteryjnej, przy której występują największe i wyraźne strefy zahamowania dla różnych stężeń spiramycyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest prowadzona na płytkach przy czterech stężeniach roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) i czterech stężeniach roztworów badanych (U₈, U₄, U₂, U₁). Po cztery stężenia wzorca i roztworów badanych muszą być umieszczone na każdej płytce. Aby to uzyskać, należy wybrać płytki o takich rozmiarach, aby można było w agarze wyciąć 8 studzienek o średnicy od 10 do 13 mm i o odległości pomiędzy środkami studzienek nie mniejszej niż 30 mm. Badania mogą być prowadzone na szklanych płytkach, na których umieszczono aluminiowy lub plastikowy pierścień o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką ilość pożywki (4.2), zaszczepioną według (7.1), aby otrzymać warstwę o grubości 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić w pozycji poziomej, wyciąć studzienki i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów badanych i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na studzienkę, w zależności od średnicy).

Nanieść każde stężenie co najmniej czterokrotnie; w ten sposób każde oznaczenie odpowiada pomiarowi 32 stref zahamowania.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16 do 18 godzin w temperaturze 30°C ± 2°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnicę stref zahamowania z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść średnią pomiarów dla każdego stężenia na papier o skali półlogarytmicznej w układzie: stężenie na skali półlogarytmicznej - średnica stref zahamowania na skali arytmetycznej. Wykreślić przez uzyskane "uśrednione punkty" linie dla roztworów wzorcowych i badanych według poniższego przykładu. Określić "uśredniony punkt" dla najniższego stężenia wzorca (SL) według wzoru:

         7 S₁ + 4 S₂ + S₄ - 2 S₈

(a) SL = -------------------------.

                 10

Określić uśrednioną wartość wielkości stref zahamowania dla najwyższego stężenia wzorca (SH) według wzoru:

         7 S₈ + 4 S₄ + S₂ - 2 S₁

(b) SH = -------------------------.

                  10

Podobnie obliczyć uśrednione wartości wielkości stref zahamowania dla najniższego stężenia badanego ekstraktu (UL) i stężenia najwyższego (UH), zastępując S₁, S₂, S₄, S₈ - U₁, U₂, U₄, U₈ w powyższych wzorach.

Nanieść obliczone wartości SL i SH na ten sam papier i wykreślić prostą dla roztworu wzorcowego. Podobnie nanieść wartości UL i UH i wykreślić prostą dla roztworu badanego.

W przypadku braku interferencji proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeżeli wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10% od ich średniej wartości.

Jeżeli proste nie spełniają warunku równoległości, U₁ i S₁ lub U₈ i S₈ mogą być odrzucone, a SL, SH, UL i UH obliczone z alternatywnych wzorów, dając alternatywne "uśrednione linie".

         5 S₁ + 2 S₂ - S₄      5 S₂ + 2 S₄ - S₈

(a') SL = ----------------- lub -----------------,

               6                   6

         5 S₄ + 2 S₂ - S₁      5 S₈ + 2 S₄ - S₂

(b') SH = ----------------- lub -----------------

                6                     6

i podobnie dla UL i UH. To samo kryterium równoległości powinno być zastosowane. Obliczanie wyników na podstawie 3 punktów należy odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste spełniają warunek równoległości, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) na podstawie jednego z poniższych wzorów, w zależności od liczby punktów, według których oceniano równoległość.

Dla 4 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

(c) log A = -----------------------------------------------,

                U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Dla 3 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ - S₁ - S₂ - S₄) x 0,401

(d) log A = --------------------------------------

                      U₄ + S₄ - U₁ - S₁

lub

            (U₂ + U₄ + U₈ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,401

(d') log A = --------------------------------------

                       U₈ + S₈ - U₂ - S₂

Aktywność ekstraktu próbki = aktywność stosownego wzorca x A

U₈ = S₈ x A

Jeżeli względna aktywność nie mieści się w przedziale od 0,5 do 2,0, należy powtórzyć oznaczenie, wprowadzając odpowiednią korektę stężenia ekstraktów lub, jeżeli nie jest to możliwe, roztworów wzorcowych. Gdy względna aktywność nie mieści się nadal w wymaganym przedziale, uzyskane wyniki należy traktować jako przybliżone i odnotować w końcowym raporcie z badań.

Gdy proste nie spełniają warunku równoległości, należy powtórzyć oznaczenie. Jeżeli warunek równoległości nie jest nadal spełniany, nie będzie uzyskany zadowalający wynik oznaczenia. Wyrazić wynik w mg spiramycyny na kg paszy.

9. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez jednego analityka nie może przekraczać:

-   2 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości spiramycyny do 10 mg/kg,

-   20% wartości wyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg,

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 25 do 50 mg/kg,

-   10% wartości wyższego wyniku dla zawartości ponad 50 mg/kg.

6.5. OZNACZANIE AWOPARCYNY METODĄ DYFUZJI W ŻELU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania awoparcyny w mieszankach, koncentratach i premiksach paszowych. Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg/kg (2 ppm). Obecność antybiotyków polieterowych może interferować przy oznaczaniu.

2. ZASADA METODY

Metoda polega na ekstrakcji awoparcyny przy użyciu mieszaniny aceton / woda / kwas chlorowodorowy. Aktywność antybiotyku jest oznaczana przez pomiar dyfuzji awoparcyny w ośrodku agarowym zaszczepionym Bacillus subtilis. Dyfuzja jest widoczna w postaci stref zahamowania wzrostu mikroorganizmu. Średnica stref zahamowania jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Utrzymywanie szczepu testowego

Przeszczepić Bacillus subtilis na skos agarowy sporządzony na pożywce. Inkubować przez noc w temperaturze 30°C.

Przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C i co miesiąc przeszczepiać na świeży skos.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej

Można stosować inne metody pod warunkiem, że uzyskuje się podobną zawiesinę bakteryjną.

Zmyć bakterie z ostatnio przygotowanego skosu agarowego (3.1) przy użyciu 2 do 3 ml wody jałowej. Uzyskaną suspensją zaszczepić 300 ml roztworu podłoża (4.1) w butelce Roux i inkubować przez 5 dni w temperaturze 30°C. Po okresie inkubacji sprawdzić zarodniki pod mikroskopem, zmyć hodowlę 15 ml etanolu i zamieszać. Trwałość zawiesiny wynosi do 5 miesięcy w temperaturze 4°C.

4. POŻYWKI, ODCZYNNIKI I ROZTWORY

4.1. Pożywka

Można zastosować gotową pożywkę o podobnym składzie i dającą takie same rezultaty.

Pepton                  6,0 g

Trypton                 4,0 g

Ekstrakt drożdżowy      3,0 g

Ekstrakt mięsny         1,5 g

Glukoza                 1,0 g

Agar                    15,0 g

Woda                    1.000 ml

pH                      6,5 (po wyjałowieniu).

4.2. Etanol 20% (V/V): rozcieńczyć 200 ml etanolu w 800 ml wody

4.3. Kwas chlorowodorowy (d = 1,18 do 1,19 g/ml)

4.4. Wodorotlenek sodu, roztwór 2 M

4.5. Bufor fosforanowy, 0,1 M

Diwodorofosforan(V) potasu KH₂PO₄ (13,6 g). Woda do 1.000 ml. pH = 4,5.

4.6. Mieszanina: aceton / woda / kwas chlorowodorowy cz.d.a. (4.3): 65/32,5/2,5 (V/V/V)

4.7. Substancja wzorcowa: awoparcyna o znanej aktywności

5. ROZTWORY WZORCOWE

Odważyć taką ilość substancji wzorcowej (4.7), która zawierałaby 10 mg substancji czystej i rozpuścić w buforze fosforanowym (4.5). Następnie dodać tyle buforu fosforanowego, aby otrzymać roztwór zawierający 100 mg awoparcyny w 1 ml. Uzyskany roztwór ma trwałość dwa dni przy przechowywaniu w lodówce w temperaturze 4°C. Jest to podstawowy roztwór wzorcowy.

5.1. Dla premiksów

Z roztworu podstawowego przygotować, metodą kolejnych rozcieńczeń oraz przy użyciu buforu fosforanowego (4.5) o pH 6,5 (4.5), następujące roztwory:

S₈       4,0 µg/ml

S₄       2,0 µg/ml

S₂       1,0 µg/ml

S₁       0,5 µg/ml.

5.2. Dla pasz

Z podstawowego roztworu wzorcowego przez kolejne rozcieńczenia buforem fosforanowym (4.5) przygotować następujące roztwory:

S₈       2,0 µg/ml

S₄       1,0 µg/ml

S₂       0,5 µg/ml

S₁       0,25 µg/ml.

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU I ROZTWORÓW DO OZNACZANIA

6.1. Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 10 mg, taką ilość próbki, której odpowiada 10 - 100 mg awoparcyny. Umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml około 60 ml mieszaniny (4.6) i mieszać przez 15 minut mieszadłem magnetycznym. Ustawić pH = 2 za pomocą kwasu chlorowodorowego (4.3). Uzupełnić kolbę do kreski mieszaniną (4.6) i wymieszać. Przesączyć przez odpowiedni sączek (np. Whatman Nr 1), odrzucając pierwsze 5 ml filtratu. Ustawić pH = 4,5 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (4.4). Rozcieńczyć roztwór buforem (4.5) do uzyskania stężenia awoparcyny 4 µg/ml (= U₈).

Z tego roztworu przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość: 2 µg/ml), U₂ (oczekiwana zawartość: 1 µg/ml) i U₁ (oczekiwana zawartość: 0,5 µg/ml) przez kolejne rozcieńczenia (1 + 1) buforem (4.5).

6.2. Pasze

Odważyć próbkę o masie 50 g i wstrząsać przez 30 minut z 100 ml mieszaniny (4.6), używając mieszadła magnetycznego. Sklarować ekstrakt przez odwirowanie, używając zakorkowanych probówek. Następnie ustawić pH sklarowanego ekstraktu na 4,5 za pomocą roztworu wodorotlenku sodu (4.4). Roztwór rozcieńczyć buforem (4.5) w celu uzyskania U₈ (tabela 9).

Z tego roztworu poprzez odpowiednie rozcieńczenia przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość: 1 µg/ml), U₂ (oczekiwana zawartość: 0,5 µg/ml), U₁ (oczekiwana zawartość: 0,25 µg/ml).

Tabela 9

 

Przewidywany poziom awoparcyny, mg/kg	5	7,5	10	15	20	40
Masa próbki, g (±0,1 g)	50	50	50	50	50	50
Objętość mieszaniny (4.6), ml	100	100	100	100	100	100
Objętość klarownego ekstraktu, ml	20	15	20	15	20	10
Końcowa objętość (ml): U8	25	25	50	50	100	100
Oczekiwane stężenie Ux (µg/ml)	2	około 2	2	około 2	2	2

 

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Zaszczepienie pożywki do badań

Zaszczepić pożywkę do badań (4.1) zawiesiną bakteryjną (3.2) przy temperaturze około 50 - 60°C. Poprzez przeprowadzenie wstępnych prób na płytkach przy użyciu pożywki do badań (4.1) określić ilość zawiesiny bakteryjnej, przy której występują największe i wyraźne strefy zahamowania dla różnych stężeń awoparcyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest prowadzona na płytkach przy 4 stężeniach roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) i 4 stężeniach roztworów badanych (U₈, U₄, U₂, U₁). Po cztery stężenia wzorca i roztworów badanych muszą być umieszczone na każdej płytce. Aby to uzyskać, należy wybrać płytki o takich rozmiarach, aby można było w agarze wyciąć 8 studzienek o średnicy od 10 do 13 mm i o odległości pomiędzy środkami studzienek nie mniejszej niż 30 mm. Badania mogą być prowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką ilość pożywki (4.1), zaszczepioną według (7.1), aby otrzymać warstwę o grubości 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić w pozycji poziomej, wyciąć studzienki i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów badanych i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na studzienkę, w zależności od średnicy).

Wykonać oznaczenie w 4 powtórzeniach, co odpowiada pomiarowi 32 stref zahamowania.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 16 do 18 godzin w temperaturze 30°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnicę stref zahamowania z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść średni pomiar dla każdego stężenia na papier o skali półlogarytmicznej, pokazując zależność logarytmu stężenia od średnicy stref zahamowania. Wykreślić przez uzyskane "uśrednione punkty" linie proste dla roztworów wzorcowych i ekstraktu, według poniższego przykładu.

Określić "uśredniony punkt" dla najniższego stężenia wzorca (SL) według wzoru:

         7S₁ + 4S₂ + S₄ - 2S₈

(a) SL = ----------------------

                 10

Określić "uśredniony punkt" dla najwyższego stężenia wzorca (SH) według wzoru:

        7S₈ + 4S₄ + S₂ -2 S₁

(b) SH = --------------------

                 10

Podobnie obliczyć "uśrednione punkty" dla najniższego stężenia badanego ekstraktu (UL) i stężenia najwyższego (UH), zastępując S - U w powyższych wzorach.

Nanieść obliczone wartości SL i SH na ten sam papier i wykreślić prostą dla roztworu wzorcowego. Podobnie nanieść wartości UL i UH i wykreślić prostą dla roztworu badanego.

W przypadku braku interferencji proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równoległe, jeżeli wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10% od ich średniej wartości. Jeżeli proste nie spełniają warunku równoległości, U₁ i S₁ lub U₈ i S₈ mogą być odrzucone, a SL, SH, UL i UH obliczone z alternatywnych wzorów, dając alternatywne "uśrednione punkty".

         5S₁ + 2S₂ - S₄      5S₂ + 2S₄ - S₈

(a') SL = --------------- lub ---------------

               6                   6

         5S₄ + 2S₂ - S₁     5S₈ + 2S₄ - S₂

(b') SH = --------------- lub ---------------

                6                  6

i podobnie dla UL i UH. Proste wykreślone na podstawie nowych, alternatywnych punktów należy poddać ocenie równoległości jak powyżej. Obliczanie wyników na podstawie 3 punktów należy odnotować w końcowym raporcie z badań. Gdy proste spełniają warunek równoległości, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) na podstawie jednego z poniższych wzorów:

Dla 4 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

(c) log A = ------------------------------------------------,

                 U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Dla 3 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ - S₁ - S₂ - S₄) x 0,401

(d) log A = --------------------------------------

                     U₄ + S₄ - U₁ - S₁

lub

            (U₂ + U₄ + U₈ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,401

(d') log A = --------------------------------------

                      U₈ + S₈ - U₂ - S₂

Rzeczywista aktywność = domniemana aktywność x względna aktywność

Gdy względna aktywność wykracza poza zakres od 0,5 do 2,0, należy powtórzyć oznaczanie, dopasowując stężenie ekstraktu lub, jeśli to możliwe, roztworów wzorcowych. Jeżeli nie można uzyskać względnej aktywności w żądanym przedziale, wtedy wynik traktować jako przybliżony, co należy zaznaczyć w końcowym raporcie.

Gdy proste nie spełniają warunku równoległości, należy powtórzyć oznaczenie. Jeżeli warunek równoległości nie jest nadal spełniony, uzyskany wynik w takim przypadku traktować jako niesatysfakcjonujący. Należy to odnotować w końcowym raporcie.

9. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez jednego analityka nie może przekraczać:

-   2 mg/kg wartości bezwzględnej przy zawartości awoparcyny od 2 do 10 mg/kg,

-   20% wartości wyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg,

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 25 do 50 mg/kg,

-   10% wartości wyższego wyniku dla zawartości ponad 50 mg/kg.

6.6. OZNACZANIE SOLI SODOWEJ MONENZYNY METODĄ DYFUZJI W ŻELU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania monenzyny w mieszankach, koncentratach i premiksach paszowych. Granica oznaczalności metody wynosi 10 mg/kg (10 ppm)¹⁴⁾.

2. ZASADA METODY

Metoda polega na ekstrakcji monenzyny 90% metanolem. Następnie, w zależności od zawartości monenzyny w próbce, ekstrakt poddajemy odpowiedniej procedurze. Aktywność antybiotyku jest oznaczana przez pomiar dyfuzji awoparcyny w ośrodku agarowym zaszczepionym Bacillus subtilis. Dyfuzja jest widoczna w postaci stref zahamowania wzrostu mikroorganizmu. Średnica stref zahamowania jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku. Czułość metody zmniejszają jony sodowe.

3. MIKROORGANIZM: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Przechowywanie szczepu testowego

Posiać Bacillus subtilis na skos agarowy sporządzony na pożywce. Inkubować przez noc w temperaturze 30°C.

Przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C i co miesiąc przesiewać na świeży skos.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej¹⁵⁾

Zmyć bakterie z ostatnio przygotowanego skosu agarowego (3.1) przy użyciu 2 do 3 ml wody jałowej. Uzyskaną zawiesiną zaszczepić 300 ml roztworu podłoża (4.1) w butelce Roux i inkubować przez 5 dni w temperaturze 30°C. Po okresie inkubacji zmyć hodowlę 15 ml 20% etanolu (4.3.) i sprawdzić zarodniki pod mikroskopem.

4. POŻYWKI, ODCZYNNIKI I ROZTWORY

4.1. Pożywka do hodowli¹⁶⁾

Trypton                 10,0 g

Ekstrakt drożdżowy      3,0 g

Ekstrakt mięsny         1,5 g

Glukoza                 1,0 g

Agar                    10,0-20,0 g

Woda                    1.000 ml

pH                      6,5 (po wyjałowieniu).

4.2. Pożywka do oznaczania

Glukoza                               10,0 g

Ekstrakt drożdżowy                    2,5 g

Wodorofosforan(V) dipotasowy K₂HPO₄   0,69 g

Diwodorofosforan(V) potasowy KH₂PO₄   0,45 g

Agar                                  10,0-20,0 g

Woda                                  1.000 ml

pH                                    6 (po sterylizacji).

4.3. Etanol 20% (V/V): rozcieńczyć 200 ml etanolu w 800 ml wody

4.4. Metanol, bezwodny

4.5. Metanol 90% (V/V): 900 ml metanolu (4.4) rozcieńczyć 100 ml wody

4.6. Metanol 50% (V/V): 500 ml metanolu (4.4) rozcieńczyć 500 ml wody

4.7. Tlenek glinu, granulat (Alcoa F, 20 mesh; aktywowany glin UG1; F. Lancaster & Co. lub podobne)

4.8. Substancja wzorcowa: sól sodowa monenzyny o znanej aktywności (np. z International Laboratory for Biological Standards, Weybridge, UK-Surrey KT 15 3 NB)

5. APARATURA I SPRZĘT

5.1. Obrotowy odparowywacz próżniowy z okrągłodenną kolbą o pojemności 250 ml

5.2. Szklana kolumna chromatograficzna: średnica wewnętrzna 25 mm, długość 400 mm, otwarty koniec o średnicy 2 mm

5.3. Szklana kolumna chromatograficzna: średnica wewnętrzna 11 mm, długość około 300 mm, otwarty koniec o średnicy 2 mm

6. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić taką ilość substancji wzorcowej (4.8) w metanolu (4.4), aby otrzymać roztwór zawierający 800 µg monenzyny w ml. Uzyskany roztwór ma trwałość dwa tygodnie przy przechowywaniu w lodówce o temperaturze 4°C. Jest to podstawowy roztwór wzorcowy.

Z roztworu podstawowego przygotować, metodą kolejnych rozcieńczeń 50% metanolem (4.6), następujące roztwory:

S₈       8,0 µg/ml

S₄       4,0 µg/ml

S₂       2,0 µg/ml

S₁       1,0 µg/ml.

7. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

7.1. Ekstrakcja

7.1.1. Premiksy

Odważyć 2 g próbki, dodać 100 ml 90% metanolu (4.5), zhomogenizować i wirować przez 5 minut. Roztwór znad osadu rozcieńczyć 50% metanolem tak, aby otrzymać roztwór o zawartości monenzyny 8 µg/ml (= U₈ ).

7.1.2. Pasze zawierające nie mniej niż 50 ppm monenzyny

Odważyć próbkę o masie 10 - 20 g, dodać 100 ml 90% metanolu (4.5), homogenizować przez 15 minut i odstawić.

Wąski koniec kolumny (5.2) zatkać watą bawełnianą i wsypywać tlenek glinowy, lekko postukując kolumną o blat stołu.

Napełnić kolumnę na wysokość 75 - 80 mm. Następnie nanieść na kolumnę ekstrakt i zebrać filtrat. Odmierzyć 30 ml filtratu i rozcieńczyć go do 50 ml wodą. Roztwór ten następnie rozcieńczyć taką ilością 50% metanolu (4.6), aby otrzymać stężenie monenzyny 8 µg/ml (= U₈).

7.1.3. Paszowe zawierające nie więcej niż 50 mg/kg (nie mniej niż 10 mg/kg) monenzyny

Odważyć próbkę o masie 10 - 20 g, dodać 100 ml 90% metanolu (4.5), homogenizować przez 15 minut. Wirować aż do uzyskania klarownego roztworu.

W przypadku próbki zawierającej 20 mg/kg monenzyny wziąć do dalszych czynności 40 ml cieczy znad osadu. Gdy próbka zawiera 10 mg/kg substancji, wziąć 80 ml i odparować na obrotowym odparowywaczu próżniowym (5.1) w temperaturze nie wyższej niż 40°C. Pozostałość rozpuścić w 10 ml 90% metanolu (4.5).

Wąski koniec kolumny (5.3) zamknąć bawełnianą watą i wsypywać tlenek glinu, lekko postukując kolumną o blat stołu.

Napełnić kolumnę na wysokość 75 - 80 mm. Następnie nanieść na kolumnę metanolowy roztwór znad osadu i zebrać wyciek. Przemyć kolumnę 10 ml 90% metanolu (4.5) i roztwór z przemycia połączyć z wcześniejszym wyciekiem.

Roztwór odparować do sucha na obrotowym odparowywaczu próżniowym (5.1) w temperaturze do 40°C. Pozostałość rozpuścić w 10 ml bezwodnego metanolu (4.4) i uzupełnić do 20 ml wodą. Przez 5 minut roztwór odwirowywać przy 4.000 obr/min. Sporządzić odpowiednie rozcieńczenie przy użyciu 50% metanolu, by oczekiwana zawartość monenzyny wynosiła 8 µng/ml (=U₈).

7.2. Roztwory badane

Z roztworu U₈ poprzez odpowiednie rozcieńczenia za pomocą 50% metanolu przygotować roztwory U₄ (oczekiwana zawartość: 4 µg/ml), U₂ (oczekiwana zawartość: 2 µg/ml), U₁ (oczekiwana zawartość: 1 µg/ml).

8. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

8.1. Zaszczepienie pożywki do badań

Zaszczepić pożywkę do badań (4.2) zawiesiną bakteryjną (3.2) przy temperaturze około 50°C - 60°C. Poprzez przeprowadzenie wstępnych prób na płytkach przy użyciu pożywki do badań (4.1) określić ilość zawiesiny bakteryjnej, przy której występują największe i wyraźne strefy zahamowania dla różnych stężeń monenzyny.

8.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest prowadzona na płytkach przy 4 stężeniach roztworów wzorcowych (S₈, S₄, S₂, S₁) i 4 stężeniach roztworów badanych (U₈, U₄, U₂, U₁). Po cztery stężenia wzorca i roztworów badanych muszą być umieszczone na każdej płytce. Aby to uzyskać, należy wybrać płytki o takich rozmiarach, aby można było w agarze wyciąć 8 studzienek o średnicy od 10 do 13 mm i w odległości pomiędzy środkami studzienek nie mniejszej niż 30 mm. Badania mogą być prowadzone na płytkach składających się ze szklanej podstawy i aluminiowego lub plastikowego pierścienia umieszczonego na płytce, o średnicy 200 mm i wysokości 20 mm.

Rozlać na płytki taką ilość pożywki (4.2), zaszczepioną według (8.1), aby otrzymać warstwę o grubości 2 mm (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić w pozycji poziomej, wyciąć studzienki i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów badanych i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na studzienkę, w zależności od średnicy).

Wykonać oznaczenie w 4 powtórzeniach, co odpowiada pomiarowi 32 stref zahamowania.

8.3. Inkubacja

Inkubować płytki przez 18 godzin w temperaturze od 35°C do 37°C.

9. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnicę stref zahamowania z dokładnością do 0,1 mm. Nanieść średni pomiar dla każdego stężenia na papier o skali półlogarytmicznej, pokazując zależność logarytmu stężenia od średnicy stref zahamowania. Wykreślić przez uzyskane "uśrednione punkty" proste dla roztworów wzorcowych i ekstraktu według poniższego przykładu. Określić "uśredniony punkt" dla najniższego stężenia wzorca (SL) według wzoru:

       7S₁ + 4S₂ + S₄ - 2S₈

(a) SL = ---------------------

               10

Określić "uśredniony punkt" dla najwyższego stężenia wzorca (SH) według wzoru:

         7S₈ + 4S₄ + S₂ - 2S₁

(b) SH = ----------------------

                 10

Podobnie obliczyć "uśrednione punkty" dla najniższego stężenia badanego ekstraktu (UL) i stężenia najwyższego (UH), zastępując S - U w powyższych wzorach.

Nanieść obliczone wartości SL i SH na ten sam papier i wykreślić prostą dla roztworu wzorcowego. Podobnie nanieść wartości UL i UH i wykreślić prostą dla roztworu badanego. W przypadku braku interferencji, proste powinny być równoległe. W praktyce proste mogą być uznane za równolegle, jeżeli wartości (SH-SL) i (UH-UL) nie różnią się więcej niż o 10% od ich średniej wartości.

Jeżeli proste nie spełniają warunku równoległości, U₁ i S₁ lub U₈ i S₈ mogą być odrzucone, a SL, SH, UL i UH obliczone z alternatywnych wzorów, dając alternatywne "uśrednione punkty".

        5S₁ + 2S₂ - S₄     5S₂ + 2S₄ - S₈

(a')SL = --------------- lub ---------------,

              6                   6

         5S₄ + 2S₂ - S₁      5S₈ + 2S₄ - S₂

(b') SH = --------------- lub ----------------

                6                   6

i podobnie dla UL i UH. Proste wykreślone na podstawie nowych, alternatywnych punktów należy poddać ocenie równoległości jak powyżej. Obliczanie wyników na podstawie 3 punktów należy odnotować w końcowym raporcie z badań. Gdy proste spełniają warunek równoległości, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) na podstawie jednego z poniższych wzorów:

Dla 4 punktów

            (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

(c) log A = -------------------------------------------------,

                U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Dla 3 punktów

           (U₁ + U₂ + U₄ - S₁ - S₂ - S₄)x 0,401

(d) log A = -------------------------------------

                     U₄ + S₄ - U₁ - S₁

lub

           (U₂ + U₄ + U₈ - S₂ - S₄ - S₈)x 0,401

(d') log A = -------------------------------------

                     U₈ + S₈ - U₂ - S₂

Rzeczywista aktywność = domniemana aktywność x względna aktywność

Gdy względna aktywność wykracza poza zakres od 0,5 do 2,0, należy powtórzyć oznaczanie, dopasowując stężenie ekstraktu lub, jeśli to możliwe, roztworów wzorcowych. Jeżeli nie można uzyskać względnej aktywności w żądanym przedziale, wtedy wynik traktować jako przybliżony, co należy zaznaczyć w końcowym raporcie.

Gdy proste nie spełniają warunku równoległości, należy powtórzyć oznaczenie. Jeżeli warunek równoległości nie jest nadal spełniony, uzyskany wynik w takim przypadku traktować jako niesatysfakcjonujący. Należy to odnotować w końcowym raporcie.

9. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tej samej próbki, wykonanych przez jednego analityka nie może przekraczać:

-   20% wartości wyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg,

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 25 do 50 mg/kg,

-   10% wartości wyższego wyniku dla zawartości ponad 50 mg/kg.

6.7. OZNACZANIE SOLI SODOWEJ LASALOCIDU METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

(sól sodowa polieterowego monokarboksylowego kwasu wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania soli sodowej lasalocidu w mieszankach paszowych i premiksach. Granica detekcji metody wynosi 5 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 30 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Sól sodowa lasalocidu jest ekstrahowana z próbki zakwaszonym metanolem i oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z detektorem spektrofluorometrycznym i wykorzystaniem techniki odwróconych faz.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Diwodorofosforan(V) potasu (KH₂PO₄)

3.2. Kwas ortofosforowy, w = 85%

3.3. Roztwór kwasu ortofosforowego, s = 20%

Rozcieńczyć 23,5 ml kwasu ortofosforowego (3.2) do 100 ml wodą.

3.4. 6-metylo-2-heptyloamina (1,5-dimetyloheksyloamina), w = 99%

3.5. Metanol, czysty do HPLC

3.6. Kwas chlorowodorowy, r₂₀ 1,19 g/ml

3.7. Bufor fosforanowy, c = 0,01 mol/l

Rozpuścić 1,36 g KH₂PO₄ (3.1) w 500 ml wody (3.11), dodać 3,5 ml kwasu ortofosforowego (3.2) i 10,0 ml 6-metylo-2-heptyloaminy (3.4). Doprowadzić pH do 4,0 roztworem kwasu ortofosforowego (3.3) i rozcieńczyć do 1.000 ml wodą (3.11).

3.8. Zakwaszony metanol

Przenieść 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.6) do kolby miarowej o pojemności 1.000 ml, dopełnić do kreski metanolem (3.5) i zamieszać. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.9. Faza ruchoma HPLC, bufor fosforanowy - metanol 5 + 95 (V + V)

Zmieszać 5 ml buforu fosforanowego (3.7) z 95 ml metanolu (3.5).

3.10. Substancja wzorcowa soli sodowej lasalocidu o gwarantowanej czystości, C₃₄H₅₃O₈Na (sól sodowa polieterowego monokarboksylowego kwasu wytwarzanego przez Streptomyces lasaliensis), E 763

3.10.1. Roztwór wzorcowy podstawowy soli sodowej lasalocidu, 500 µg/ml

Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg soli sodowej lasalocidu (3.10) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w zakwaszonym metanolu (3.8), dopełnić do kreski tym samym rozpuszczalnikiem i zamieszać. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.2. Roztwór wzorcowy pośredni soli sodowej lasalocidu, 50 µg/ml

Odpipetować 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego soli sodowej lasalocidu (3.10.1) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, dopełnić do kreski zakwaszonym metanolem (3.8) i zamieszać. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10.3. Roztwory wzorcowe kalibracyjne

Do serii kolb miarowych o pojemności 50 ml przenieść 1,0; 2,0; 4,0; 5,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego pośredniego (3.10.2). Dopełnić do kreski zakwaszonym metanolem (3.8) i zamieszać. Roztwory odpowiadają stężeniom odpowiednio 1,0; 2,0; 4,0; 5,0 i 10,0 µg soli sodowej lasalocidu w 1 ml. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.11. Woda, o czystości do HPLC

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Łaźnia ultradźwiękowa (lub wibracyjna łaźnia wodna) z możliwością kontroli temperatury

4.2. Filtry membranowe, 0,45 µm

4.3. Zestaw HPLC z systemem dozowania, umożliwiający dozowanie 20 µl

4.3.1. Kolumna do wysokosprawnej chromatografii cieczowej 125 mm x 4 mm, faza odwrócona C₁₈, wypełnienie 5 µm lub podobne

4.3.2. Spektrofluorymetr o zmiennej fali, z możliwością ustawienia długości fali wzbudzenia i emisji

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Objaśnienia

5.1.1. Ślepa próba paszy

W celu przeprowadzenia badania odzysku (5.1.2) należy przeprowadzić analizę ślepej próby paszy w celu sprawdzenia, że badana pasza nie zawiera ani lasalocidu, ani interferujących substancji. Pasza użyta do ślepej próby powinna być podobnego rodzaju do próbki paszy badanej.

5.1.2. Badanie odzysku

Badanie odzysku należy przeprowadzić, poddając analizie próbką ślepą paszy z dodatkiem znanej ilości soli sodowej lasalocidu, podobnej do tej, jaka występuje w próbce badanej. W celu wprowadzenia dodatku 100 mg/kg, przenieść 10,0 ml roztworu wzorcowego podstawowego (3.10.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do około 0,5 ml. Dodać 50 g ślepej próbki paszy, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 minut, kilkakrotnie mieszając, przed rozpoczęciem etapu ekstrakcji (5.2).

Alternatywnie, gdy ślepa próbka paszy podobna do tej, która występuje w badanej próbce, nie jest dostępna (5.1.1), badanie odzysku może być przeprowadzone metodą dodatku wzorca. W tym przypadku analizowana próbka jest fortyfikowana solą sodową lasalocidu w ilości podobnej do tej, jaka już występuje w próbce. Próbka jest analizowana wraz ze ślepą próbką bez dodatku soli sodowej lasalocidu i odzysk jest obliczany przez odjęcie.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Mieszanki paszowe

Zważyć, z dokładnością do 0,01 g, od 5 g do 10 g próbki do kolby stożkowej o pojemności 250 ml z korkiem. Dodać 100 ml zakwaszonego metanolu (3.8) przy użyciu pipety. Zamknąć korkiem i wstrząsnąć w celu zdyspergowania. Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (4.1) przy temperaturze 40°C na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Pozostawić kolbę na około 1 h, dopóki substancja nie opadnie, następnie przefiltrować część roztworu przez filtr membranowy 0,45 µm (4.2) do odpowiedniego naczynia. Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.2.2. Premiksy

Zważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 2 g rozdrobnionego premiksu do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Dodać 100 ml zakwaszonego metanolu (3.8) i wstrząsnąć w celu zdyspergowania. Umieścić kolbę z zawartością w łaźni ultradźwiękowej (4.1) przy temperaturze 40°C na 20 minut, następnie wyjąć i schłodzić do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć do kreski zakwaszonym metanolem (3.8) i dokładnie wymieszać. Pozostawić kolbę na około 1 h, dopóki substancja nie opadnie, następnie przefiltrować część roztworu przez filtr membranowy 0,45 µm (4.2). Rozcieńczyć do odpowiedniej objętości klarowny filtrat przy użyciu zakwaszonego metanolu (3.8) w celu otrzymania ostatecznego roztworu badanego zawierającego około 4 µg/ml soli sodowej lasalocidu. Przystąpić do oznaczania HPLC (5.3).

5.3. Oznaczanie HPLC

5.3.1. Warunki oznaczania

Poniższe warunki oznaczania podano jako przykładowe; inne warunki mogą być wykorzystane w celu uzyskania podobnych wyników:

Kolumna chromatograficzna (4.3.1):    125 mm x 4 mm, faza odwrócona C₁₈,

                                      wypełnienie 5 µm lub podobne

Faza ruchoma (3.9):                   Mieszanina buforu fosforanowego (3.7)

                                      i metanolu (3.5), 5 + 95 (V + V)

Przepływ                              1,2 ml/min

Długość fali przy detekcji:

-   wzbudzenie             310 nm

-   emisja                 419 nm

Dozowana objętość:         20 µl

Określić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.10.3) o stężeniu 4,0 µg/ml, aż do uzyskania pików o stałej wysokości (lub powierzchni) i powtarzalnych czasach retencji.

5.3.2. Krzywa kalibracyjna

Dozować każdy kalibracyjny roztwór (3.10.3) kilka razy i określić średnią wysokość piku (pole powierzchni) dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, zaznaczając średnie wysokości pików (pola powierzchni) na osi rzędnych i odpowiadające im stężenia w µg/ml na osi odciętych.

5.3.3. Roztwór próbki

Dozować ekstrakty próbki otrzymanej według (5.2.1) lub (5.2.2) kilka razy, stosując taką samą objętość jak przy roztworze kalibracyjnym, i określić średnią wysokość (pole powierzchni) piku soli sodowej lasalocidu.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Z średniej wysokości piku (pola powierzchni) otrzymanej po zadozowaniu roztworu próbki (5.3.3) odczytać stężenie soli sodowej lasalocidu (µg/ml) z krzywej kalibracyjnej.

6.1. Mieszanki paszowe

Zawartość soli sodowej lasalocidu, w mg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

    b x V₁

w = --------[mg/kg],

      m

w którym:

b -   stężenie soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (5.2.1), w µg/ml,

V₁ -  objętość ekstraktu próbki zgodnie z (5.2.1), w ml (np. 100),

m -   masa próbki analitycznej, w g.

6.2. Premiksy

Zawartość soli sodowej lasalocidu, w mg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

    b x V₂ x f

w = ------------[mg/kg],

        m

w którym:

b -   stężenie soli sodowej lasalocidu w roztworze próbki (5.2.2), w µg/ml,

V₁ -  objętość ekstraktu próbki zgodnie z (5.2.2), w ml (np. 250),

f -   współczynnik rozcieńczenia zgodnie z (5.2.2),

m -   masa próbki analitycznej, w g.

7. SPRAWDZENIE WYNIKÓW

7.1. Tożsamość

Metody bazujące na detekcji spektrofluorometrycznej są mniej podatne na interferencje niż metody oparte na detekcji UV. Tożsamość substancji analizowanej może być potwierdzona za pomocą kochromatografii.

7.1.1. Kochromatografia

Ekstrakt próbki ((5.2.1) lub (5.2.2)) jest fortyfikowany przez dodatek odpowiedniej ilości wzorcowego roztworu kalibracyjnego (3.10.3). Ilość dodanej soli sodowej lasalocidu powinna być podobna do ilości soli sodowej lasalocidu w ekstrakcie próbki. Tylko wysokość piku soli sodowej lasalocidu powinna wzrosnąć w stopniu zależnym od ilości dodanej soli sodowej lasalocidu i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie wysokości powinna odpowiadać z dokładnością ± 10% szerokości piku oryginalnej próbki otrzymanej z badanego ekstraktu.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń próbki nie może przekraczać:

-   15% wartości względnej w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości soli sodowej lasalocidu w zakresie od 30 mg/kg do 100 mg/kg;

-   15 mg/kg dla zawartości soli sodowej lasalocidu od 100 mg/kg do 200 mg/kg;

-   7,5% wartości względnej w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości soli sodowej lasalocidu powyżej 200 mg/kg.

7.3. Odzysk

Odzysk soli sodowej lasalocidu dodanej do ślepej próbki mieszanki paszowej nie może być niższy od 80%. W przypadku fortyfikowanych próbek premiksów odzysk nie może być niższy od 90%.

6.8. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI SOLI SODOWEJ SALINOMYCYNY METODĄ MIKROBIOLOGICZNĄ

1. CEL I ZAKRES

Mikrobiologiczna metoda płytkowo-cylinderkowa służy do oznaczania soli sodowej salinomycyny w preparatach handlowych, premiksach, koncentratach i mieszankach paszowych.

2. ZASADA METODY

Zasada metody polega na pomiarze średnicy kolistych stref zahamowania wzrostu szczepu testowego Bacillus subtilis ATCC 6633 i obliczeniu na tej podstawie zawartości soli sodowej salinomycyny.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Podczas analizy, jeżeli nie zaznaczono inaczej, należy stosować wyłącznie odczynniki cz.d.a. oraz wodę destylowaną lub wodę o równoważnej czystości. W przypadku stosowania roztworów sterylnych sterylizację prowadzić w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15 min. Szkło należy sterylizować w suszarce laboratoryjnej w temperaturze od 170°C do 175°C przez 1 h.

3.1. Substancja wzorcowa - sól sodowa salinomycyny

3.2. Metanol

3.3. Metanol, cz., roztwór 90% (V/V)

3.4. Metanol, cz., roztwór 45% (V/V)

3.5. Etanol, roztwór 20% (V/V)

3.6. Wodorotlenek sodu, roztwór o c (NaOH) = 1 mol/l

3.7. Trójtlenek diglinu, aktywność II/III według Brockmana

3.8. Papier półlogarytmiczny lub milimetrowy

4. APARATURA I SPRZĘT

Do wykonania badania stosowane są:

4.1. Autoklaw

4.2. Cieplarka

4.3. Aparat Kocha

4.4. Wstrząsarka laboratoryjna

4.5. Wyparka próżniowa

4.6. Pehametr

4.7. Urządzenie do pomiaru stref zahamowania lub suwmiarka

4.8. Cylinderki ze stali kwasoodpornej, o średnicy zewnętrznej 8 mm, średnicy wewnętrznej 6 mm i wysokości 10 mm

4.9. Kolumny szklane o długości około 30 cm i średnicy wewnętrznej około 3 cm, zwężone u dołu, z kranem

4.10. Płytki Petriego o średnicy od 10 cm do 15 cm

4.11. Butelki Roux

5. POŻYWKI I SZCZEP TESTOWY

5.1. Pożywka do hodowli i przechowywania szczepu testowego

Do sporządzenia pożywki stosować następujące składniki:

Trypton (wyciąg trzustkowy kazeiny)  10,0 g

Ekstrakt drożdżowy                3,0 g

Ekstrakt mięsny                   1,5 g

Glukoza                           1,0 g

Agar                              od 10,0 g do 20,0 g

Woda destylowana                  do 1.000 ml.

Składniki rozpuścić w aparacie Kocha lub autoklawie. Rozlać po około 300 ml do butelek Roux i po około 7 ml do probówek. Sterylizować. Po sterylizacji pH podłoża powinno wynosić 6,5. Ustawić butelki Roux w pozycji poziomej, a probówki w pozycji ukośnej i pozostawić do zastygnięcia podłoża.

5.2. Pożywka do wykonania oznaczeń

Do sporządzenia pożywki stosować następujące składniki:

Ekstrakt mięsny                   1,5 g

Ekstrakt drożdżowy                3,0 g

Trypton (wyciąg trzustkowy kazeiny)  4,0 g

Pepton                            6,0 g

Glukoza                           1,0 g

Agar                              od 10,0 g do 20,0 g

Woda destylowana                  do 1.000 ml.

Składniki rozpuścić w aparacie Kocha lub autoklawie. Pożywkę rozlać do kolb stożkowych. Sterylizować. Po sterylizacji pH podłoża powinno wynosić 6,5.

5.3. Szczep testowy Bacillus subtilis ATCC 6633

Na skos agarowy według (5.1) posiać drobnoustrój testowy i inkubować od 18 h do 24 h w temperaturze 30°C. Kulturę przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C i przed upływem miesiąca przesiać na nowy skos agarowy.

5.4. Przygotowanie zawiesiny komórek drobnoustroju testowego

Skosy agarowe z wyhodowanym szczepem testowym (5.3) zmyć za pomocą 3 ml sterylnej wody, używając jałowych perełek szklanych. Uzyskaną zawiesinę przenieść na podłoże w butelce Roux (5.1) i równomiernie rozprowadzić po całej powierzchni podłoża. Inkubować przez pięć dni w temperaturze 28°C do 30°C. Po okresie inkubacji zmyć hodowlę 15 ml alkoholu etylowego (3.5), używając jałowych perełek szklanych. Sprawdzić pod mikroskopem zdolność wytwarzania zarodników i zawiesinę dobrze wymieszać. Tak przygotowana zawiesina może być przechowywana w lodówce przez pięć miesięcy.

5.5. Określenie optymalnej ilości zawiesiny używanej w badaniu

Pożywkę do wykonania oznaczeń (5.2) rozpuścić na łaźni wodnej i rozlać po 30 ml do sześciu kolb stożkowych o pojemności 100 ml. Do każdej kolby z pożywką ostudzoną do temperatury około 50°C wprowadzić następujące ilości: 0,1 ml; 0,2 ml; 0,4 ml; 0,6 ml; 0,8 ml; 1 ml zawiesiny zarodników szczepu testowego. Zawartość kolb dobrze wymieszać i wylać na płytki Petriego taką ilość, aby uzyskać warstwę o grubości około 2 mm. Po zastygnięciu podłoża na każdej płytce umieścić trzy cylinderki. Cylinderki napełnić roztworami wzorca soli sodowej salinomycyny o stężeniach 1 µg/ml; 2 µg/ml i 4 µg/ml (S₁, S₂, S₃) według (6.2). Płytki umieścić na 1 h w lodówce, a następnie inkubować od 16 h do 18 h w temperaturze 37°C. Po inkubacji ocenić wielkość i ostrość uzyskanych stref zahamowania wzrostu i wybrać optymalną ilość zawiesiny, którą będzie się stosować w badaniach. Optymalna jest ta ilość zawiesiny, przy której uzyskuje się ostre strefy zahamowania wzrostu o następujących średnicach:

S₁ około 15 mm

S₂ około 18 mm

S₃ około 21 mm.

6. PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW WZORCA

6.1. Roztwór wzorcowy podstawowy

Odważyć z dokładnością do 0,0001 g taką ilość soli sodowej salinomycyny (3.1), aby po rozpuszczeniu w metanolu (3.2) otrzymać roztwór o stężeniu 1.000 µg/ml. Trwałość roztworu szczelnie zamkniętego i przechowywanego w lodówce wynosi dwa miesiące.

6.2. Roztwory wzorcowe robocze

Z roztworu podstawowego sporządzić w dniu wykonania oznaczania roztwory robocze o następujących stężeniach soli sodowej salinomycyny: 4 µg/ml, 2 µg/ml i 1 µg/ml (S₃, S₂, S₁). Rozcieńczyć, używając metanolu (3.4).

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Przygotowanie ekstraktów

Ekstrakty przygotować w następujący sposób:

a)   Przygotowanie ekstraktów z preparatów i premiksów

Sporządzić, z dokładnością do 0,001 g (preparat) i 0,01 g (premiks), odważkę według tabeli 10 i umieścić w kolbie stożkowej ze szlifem, o pojemności 250 ml. Dodać 100 ml metanolu (3.3) i zawartość kolby wstrząsnąć przez 1 h na wstrząsarce laboratoryjnej. Kolbę odstawić na 5 min i następnie ekstrakt sączyć przez karbowany sączek do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Kolbę uzupełnić do kreski przez popłukanie osadu i sączka 90% roztworem metanolu. Do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml pobrać odpowiednią ilość filtratu według tabeli 10 i uzupełnić do kreski 90% roztworem metanolu. Uzyskany roztwór rozcieńczyć w stosunku 1 : 2 roztworem metanolu o stężeniu 90%. Stężenie uzyskanego roztworu wynosi 8 µg/ml.

b)   Przygotowanie ekstraktów z koncentratów i mieszanek

Sporządzić, z dokładnością do 0,01 g, odważkę według tabeli 10 i umieścić w kolbie stożkowej ze szlifem, o pojemności 250 ml. Dodać 100 ml 90% metanolu (3.3) i zawartość kolby wstrząsnąć przez 1 h na wstrząsarce laboratoryjnej. Kolbę odstawić na 5 min i następnie ekstrakt sączyć przez karbowany sączek wprost na kolumnę chromatograficzną przygotowaną w następujący sposób. Do szklanej kolumny (4.9) wprowadzić niewielki zwitek waty, zamknąć kran i wlać 90% roztwór metanolu (3.4). Odważyć 25 g tlenku glinu (3.7) i wsypać do kolumny. Po opadnięciu tlenku glinu nadmiar metanolu spuścić. Pozostałość w kolbie ekstrakcyjnej przepłukiwać porcjami po około 50 ml 90% metanolu, krótko wstrząsając, i wprowadzić roztwór poprzez sączek na kolumnę chromatograficzną. Zebrać pierwsze 200 ml eluatu. W przypadku koncentratów otrzymany eluat rozcieńczyć w stosunku 1 : 5, w przypadku zaś mieszanki o zawartości soli sodowej salinomycyny na poziomie 60 mg/kg w stosunku 2:1. Rozcieńczać, używając 90% metanolu.

Stężenie roztworów po rozcieńczeniu powinno wynosić 8 µg/ml. W przypadku mieszanek zawierających sól sodową salinomycyny w ilości 30 mg/kg i 15 mg/kg pobrać z kolby o pojemności 200 ml odpowiednio: 20 ml lub 40 ml eluatu do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml i odparować rozpuszczalnik w wyparce próżniowej w temperaturze nieprzekraczającej 40°C. Pozostałość przenieść ilościowo za pomocą 90% metanolu do kolby pomiarowej o pojemności 10 ml. Uzyskany roztwór rozcieńczyć w stosunku 2 : 1 roztworem metanolu (3.3). Stężenie uzyskanego roztworu powinno wynosić 8 µg/ml.

7.2. Przygotowanie roztworów ekstraktów do badań

Roztwór o stężeniu 8 µg/ml rozcieńczyć w stosunku 1 : 1 wodą. Stężenie uzyskanego roztworu wynosi 4 µg/ml (U₃). Roztwór ten rozcieńczyć metodą kolejnych rozcieńczeń w stosunku 1 : 1 za pomocą 45% metanolu, w celu uzyskania stężeń 2,0 µg/ml (U₂) i 1 µg/ml (U₁).

7.3. Przygotowanie płytek do oznaczeń i przeprowadzenie badania

Rozpuścić uprzednio przygotowaną według (5.2) pożywkę agarową, ostudzić do temperatury około 50°C i wprowadzić optymalna ilość zawiesiny szczepu testowego określoną według (5.5). Ustawić płytki Petriego o równym dnie na wypoziomowanym stole i rozlać taką ilość zaszczepionej pożywki, aby uzyskać warstwę o grubości około 2 mm. Po zastygnięciu podłoża na każdej płytce ustawić sześć cylinderków. Dla każdego oznaczania przygotować sześć płytek. Na obwodzie płytki zaznaczyć dermatografem miejsce jednego z cylinderków i posuwając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, napełnić całkowicie cylinderki roztworami soli sodowej salinomycyny (S₁, S₂, S₃) według (6.2) oraz roztworami z badanej próbki o takich samych stężeniach soli sodowej salinomycyny (U₁, U₂, U₃) według (7.2). Płytki umieścić na 1 h w lodówce, a następnie inkubować od 16 h do 18 h w temperaturze 37°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Usunąć cylinderki i zmierzyć średnice stref zahamowania wzrostu z dokładnością do 0,1 mm. Wyniki pomiarów zapisać w tablicy i wyliczyć średnie arytmetyczne dla odpowiadających sobie stref z sześciu płytek, zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i badanego. Uzyskane średnie wykorzystać do wyliczenia uśrednionej wartości wielkości strefy zahamowania wzrostu dla najniższego SL i najwyższego SH stężenia wzorca oraz próbki i obliczyć według wzorów:

     5 S₁ + 2 S₂ - S₃

SL = ------------------                                              (1)

          6

     5 S₃ + 2 S₂ - S₁

SH = ------------------                                              (2),

          6

w których:

S₁, S₂, S₃ - średnie arytmetyczne średnic stref zahamowania wzrostu dla roztworów wzorcowych soli sodowej salinomycyny, przy stężeniach 1 µg/ml; 2 µg/ml i 4 µg/ml, w mm.

Obliczając wielkość stref zahamowania wzrostu dla próbki, korzystać z tych samych wzorów, wstawiając w miejsce symbolu S - symbol U. Znaczenie symboli S i U jest identyczne jak we wzorze na obliczanie logarytmu względnej aktywności (log A). Wyliczone wartości dla wzorca i próbki nanieść na papier półlogarytmiczny z zaznaczonymi stężeniami w µg/ml na skali logarytmicznej i średnicami stref zahamowania wzrostu w mm na skali arytmetycznej. W przypadku braku papieru półlogarytmicznego średnice stref zahamowania wzrostu odnieść do logarytmów stężeń. Przez uzyskane punkty wykreślić proste dla roztworu wzorcowego (S) i badanego (U). Otrzymane linie powinny być równoległe, co daje pewność, że podczas badania nie wystąpiły interferencje.

Linie można także uznać za równoległe, jeżeli wartości różnic SH-SL i UH-UL nie różnią się więcej niż 10% ich średniej wartości. Jeżeli warunek równoległości linii jest spełniony, obliczyć logarytm względnej aktywności salinomycyny (log A) według wzoru:

        (U₁ + U₂ + U₃ - S₁ - S₂ - S₃) x 0,401

log A = ---------------------------------------                      (3),

                S₃ - S₁ + U₃ - U_1,

w którym:

U₁, U₂, U₃ - średnie arytmetyczne średnic stref zahamowania wzrostu dla roztworów badanej próbki, przy założonych stężeniach soli sodowej salinomycyny 1 µg/ml, 2 µg/ml i 4 µg/ml, w mm.

S₁, S₂, S₃ - jak we wzorach (1) i (2),

0,410 - współczynnik przeliczeniowy.

Rzeczywistą zawartość soli sodowej salinomycyny (X) w badanej próbce obliczyć według wzoru:

X = y * z                                                            (4),

w którym:

y -  założona zawartość soli sodowej salinomycyny według tabeli 10,

z -  antylogarytm względnej aktywności.

Antylogarytm względnej aktywności soli sodowej salinomycyny powinien mieścić się w granicach od 0,5 do 2,0. Jeżeli warunek ten nie jest spełniony, oznaczanie należy powtórzyć, zwracając szczególną uwagę na odpowiednie dostosowanie stężenia ekstraktu próbki do wzorca.

9. WYNIK KOŃCOWY

Za wynik końcowy należy przyjąć średnią arytmetyczną wyników dwóch równoległych oznaczeń różniących się nie więcej niż 10% wartości błędu względnego. Wynik podać w zaokrągleniu do jednego miejsca po przecinku.

Tabela 10

DANE DLA PRZYGOTOWANIA EKSTRAKTÓW ANALIZOWANYCH PRÓBEK

 

Nazwa próbki	Założona zawartość soli sodowej salinomycyny	Masa odważki, g	Objętość pobranego filtratu, ml
Preparat	120 g/kg	1	1
	60 g/kg	1	2
Premiks	6 g/kg	10	2
	3 g/kg	10	4
Koncentrat	0,6 g/kg	16	-
	0,3 g/kg	32	-
	60 mg/kg	40	-
Mieszanka	30 mg/kg	40	-
	15 mg/kg	40	-

 

6.9. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI TYLOZYNY METODĄ MIKROBIOLOGICZNĄ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania tylozyny w preparatach handlowych, premiksach, koncentratach i mieszankach paszowych. Metodę stosuje się do pasz zawierających nie mniej niż 2 mg tylozyny w 1 kg próbki.

2. ZASADA METODY

Metoda polega na pomiarze średnicy stref zahamowania wzrostu szczepu testowego Micrococcus luteus ATCC 9341 i obliczeniu na tej podstawie zawartości tylozyny.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Podczas analizy, jeżeli nie zaznaczono inaczej, należy stosować wyłącznie odczynniki cz.d.a. oraz wodę destylowaną lub wodę o równoważnej czystości.

3.1. Substancja wzorcowa - tylozyna o znanej aktywności

3.2. Metanol, cz.

3.3. Płyn fizjologiczny - chlorek sodu - roztwór 0,9% (m/m). Roztwór sterylizować 15 min w temperaturze 121°C.

3.4. Bufor fosforanowy pH 8,0. Odważyć 0,523 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i 16,730 g wodorofosforanu dipotasu (K₂HPO₄). Oba składniki rozpuścić w wodzie. Końcowa objętość uzyskanego roztworu wynosi 1l. Bufor sterylizować 15 min w temperaturze 121°C. Po sterylizacji pH powinno wynosić 8,0.

3.5. Bufor fosforanowy pH 7,0. Odważyć 5,5 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄) i 13,6 g wodorofosforanu dipotasu (K₂HPO₄). Oba składniki rozpuścić w wodzie. Końcowa objętość uzyskanego roztworu wynosi 1l. Bufor sterylizować 15 min w temperaturze 121°C. Po sterylizacji pH powinno wynosić 7,0.

3.6. Mieszanina buforu i metanolu. Zmieszać bufor o pH 8,0 (3.4) i metanol (3.2) w stosunku 60 + 40 (V/V).

3.7. Papier półlogarytmiczny lub milimetrowy

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Autoklaw

4.2. Cieplarka

4.3. Aparat Kocha

4.4. Wstrząsarka laboratoryjna

4.5. Wyparka próżniowa

4.6. Wirówka

4.7. Pehametr

4.8. Płytki Petriego o średnicy 12 ¸ 15 cm

4.9. Korkobory o średnicy 10 ¸ 13 mm

4.10. Suwmiarka lub aparat do pomiaru stref zahamowania

4.11. Oczko bakteriologiczne

4.12. Butelki Roux

4.13. Mikropipety o różnej pojemności

5. POŻYWKI I SZCZEP TESTOWY

5.1. Pożywka do otrzymywania i przechowywania szczepu testowego

Do sporządzenia pożywki stosować następujące składniki:

Glukoza                 1,0 g

Pepton                  6,0 g

Trypton                 4,0 g

Ekstrakt mięsny         1,5 g

Ekstrakt drożdżowy      3,0 g

Agar                    15,0 g

Woda                    do 1.000 ml.

Upłynnioną pożywkę rozlać do probówek bakteriologicznych po około 3 ml i do butelek Roux po 250 ml i sterylizować przez 15 min w temperaturze 121°C. Po sterylizacji pH podłoża powinno wynosić 7,0. Butelki Roux ustawić w pozycji poziomej, a probówki w pozycji ukośnej, aż do zastygnięcia podłoża. Można stosować gotowe podłoża antybiotykowe Nr 1.

5.2. Pożywka agarowa do wykonania oznaczania

Przygotować pożywkę o składzie podanym w (5.1). Po sterylizacji pH powinno wynosić 8,0.

5.3. Szczep testowy

Micrococcus luteus ATCC 9341 przeszczepić na skos agarowy o pH 7,0 i inkubować 24 h w temperaturze 35°C. Hodowlę bakteryjną przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C i przed upływem czterech tygodni przeszczepić na nowy skos agarowy.

5.4. Przygotowanie zawiesiny zarodników szczepu testowego

Do dwóch probówek hodowli szczepu testowego na skosie wprowadzić po 2 ml sterylnego, świeżo przygotowanego płynu fizjologicznego (3.3) i zmyć hodowlę za pomocą oczka bakteriologicznego. Uzyskaną zawiesinę przenieść do butelkek Roux na podłoże przygotowane według (5.1) i równomiernie rozprowadzić po całej powierzchni podłoża. Inkubować w temperaturze 35°C przez 24 h. Po okresie inkubacji zmyć hodowlę 25 ml sterylnego płynu fizjologicznego (3.3), używając szklanych perełek. Uzyskaną zawiesinę przenieść do kolbki stożkowej ze szlifem, o pojemności 50 ml. Zawiesinę przechowywać w lodówce do 10 dni.

6. PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW WZORCOWYCH

6.1. Roztwór wzorcowy podstawowy

Odważyć na wadze analitycznej 10 - 50 mg tylozyny o znanej aktywności i rozpuścić w 5 ml metanolu cz. Otrzymany roztwór tak rozcieńczyć za pomocą buforu fosforanowego o pH 7,0, żeby uzyskać aktywność równą 1.000 mg/ml. Roztwór przechowywać w lodówce do dwóch tygodni.

6.2. Roztwory robocze

Z roztworu podstawowego przyrządzić w dniu oznaczania dalsze rozcieńczenie tylozyny mieszaniną buforu fosforanowego i metanolu (3.6) do uzyskania następujących stężeń: 0,25 mg/ml (S₁), 0,5 mg/ml (S₂), 1,0 mg/ml (S₄), 2,0 mg/ml (S₈).

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Przygotowanie ekstraktów analizowanych próbek

Sporządzić z dokładnością do 0,001 g (preparaty, premiksy) lub 0,01 g (koncentraty, mieszanki) odważkę według tabeli 11 i umieścić w kolbie stożkowej ze szlifem, o pojemności 250 ml. Dodać 60 ml buforu fosforanowego o pH 8 ogrzanego do temperatury 80°C i zawartość kolby po wymieszaniu wstrząsnąć na wstrząsarce laboratoryjnej przez 15 min. Roztwór pozostawić na 10 min i po tym czasie dodać 40 ml metanolu (3.2) i wstrząsać przez dalsze 5 min. Ekstrakt odwirować z szybkością 3.000 obr/min przy r = 0,25 m w ciągu 10 min. Pobrać odpowiednią ilość supernatantu według tabeli 11 i za pomocą mieszaniny buforu i metanolu (3.6) wykonać rozcieńczenie zgodnie z tabelą 11. Stężenie uzyskanego roztworu wynosi 2 µg/ml (U₈).

7.2. Przygotowanie roztworów ekstraktów do badań

Ekstrakty o stężeniu 2,0 µg/ml (U₈) rozcieńczyć mieszaniną buforu i metanolu (3.6) kolejno w stosunku 1 : 1 do uzyskania następujących stężeń:

1,0 µg/ml (U₄),

0,5 µg/ml (U₂),

0,25 µg/ml (U₁).

7.3. Przygotowanie płytek do oznaczeń i przeprowadzenie badania

Upłynnić uprzednio przygotowaną według (5.2) pożywkę agarową, ostudzić do temperatury 50°C i wprowadzić zawiesinę komórek szczepu testowego w ilości 0,05 ml na 30 ml pożywki. Tak przygotowaną pożywkę rozlać do jałowych płytek Petriego. Grubość warstwy pożywki powinna wynosić około 2 mm. Po wystygnięciu agaru na każdej płytce wyciąć za pomocą korkoboru po 8 otworów. Dla każdej badanej próby przygotować cztery płytki. Na obwodzie płytki zaznaczyć dermatografem miejsce jednego z otworów i posuwając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, napełnić otwory roztworami wzorca o stężeniu tylozyny 2,0 µg/ml; 1,0 µg/ml; 0,5 µg/ml i 0,25 µg/ml oraz roztworami z badanej próby o takim samym stężeniu tylozyny w ilości 0,10 - 0,15 ml na otwór. Płytki inkubować przez 18 h w temperaturze 30°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zmierzyć średnice stref zahamowania wzrostu z dokładnością do 0,1 mm. Wyniki pomiarów zapisać w tablicy i wyliczyć średnie arytmetyczne dla odpowiadających sobie stref z czterech płytek, zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i badanego. Uzyskane średnie wykorzystać do wyliczenia uśrednionej wartości wielkości stref zahamowania dla najniższego i najwyższego stężenia wzorca według wzorów. Wielkość strefy zahamowania dla najniższego stężenia wzorca SL obliczyć według wzoru:

     7 S₁ + 4 S₂ + S₄ - 2 S₈

SL = -------------------------                         (1),

             10

w którym:

S₁, S₂, S₄, S₈ - średnie arytmetyczne średnic stref zahamowania wzrostu dla roztworów wzorcowych tylozyny przy stężeniach 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 µg/ml, mm.

Wielkości strefy zahamowania dla najwyższego stężenia wzorca SH obliczyć według wzoru:

     7 S₈ + 4 S₄ + S₂ - 2 S₁

SH = -----------------------                           (2),

              10

w którym:

S₁, S₂, S₄, S₈ - jak we wzorze (1).

Obliczając wielkość stref zahamowania wzrostu dla próbki, korzystać z tych samych wzorów, wstawiając w miejsce symbolu S - symbol U. Znaczenie symboli S i U jest identyczne jak we wzorze na obliczanie logarytmu względnej aktywności (log A).

Wyliczone wartości dla wzorca i próbki nanieść na papier półlogarytmiczny z zaznaczonymi stężeniami w µg/ml na skali logarytmicznej i średnicami stref zahamowania wzrostu w mm na skali arytmetycznej. W przypadku braku papieru półlogarytmicznego średnice stref zahamowania wzrostu odnieść do logarytmów stężeń. Przez uzyskane punkty wykreślić proste dla roztworu wzorcowego (S) i badanego (U). Otrzymane linie powinny być równoległe.

Linie można także uznać za równoległe, jeżeli wartość różnic SH-SL i UH-UL nie różni się więcej niż 10% ich średniej wartości. Jeżeli warunek równoległości linii jest spełniony, obliczyć logarytm względnej aktywności tylozyny (log A) według wzoru:

       (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,602

log A = ------------------------------------------------ (3),

            U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

w którym:

U₁, U₂, U₄, U₈ - średnie arytmetyczne średnic stref zahamowania wzrostu dla roztworów badanych prób przy założonych stężeniach tylozyny 0,25; 0,5; 1,0; 2,0 µg/ml, mm.

S₁, S₂, S₄, S₈ - jak we wzorze (1),

0,602 - współczynnik przeliczeniowy.

Rzeczywistą zawartość tylozyny (X) w badanej próbce obliczyć według wzoru:

X = y * z                                              (4),

w którym:

y -  założona zawartość tylozyny, według tabeli 11,

z -  antylogarytm względnej aktywności.

Antylogarytm względnej aktywności tylozyny powinien mieścić się w zakresie od 0,5 do 2,0. Jeżeli warunek ten nie jest spełniony, oznaczenie należy powtórzyć, zwracając szczególna uwagę na odpowiednie dostosowanie stężenia ekstraktu do wzorca. W przypadku ekstraktów o bardzo małym stężeniu tylozyny ekstrakt zagęścić poprzez odparowanie rozpuszczalnika w wyparce próżniowej w temperaturze nieprzekraczającej 40°C i rozpuścić w odpowiedniej ilości mieszaniny buforu i metanolu (3.6).

9. WYNIK KOŃCOWY

Za wynik końcowy należy przyjąć średnią arytmetyczną dwóch równoległych oznaczeń różniących się nie więcej niż:

-   2 mg/kg wartości bezwzględnej, dla zawartości tylozyny od 2 do 10 mg/kg,

-   20% wartości względnej w stosunku do wyższego wyniku dla zawartości od 10 do 25 mg/kg,

-   5 mg/kg wartości bezwzględnej, dla zawartości tylozyny od 25 do 50 mg/kg,

-   10% wartości względnej w stosunku do wyższego wyniku dla zawartości od 50 do 1.000 mg/kg,

-   5% wartości względnej w stosunku do wyższego wyniku dla zawartości powyżej 1.000 mg/kg.

Tabela 11

DANE DLA PRZYGOTOWANIA EKSTRAKTÓW ANALIZOWANYCH PRÓBEK

 

Nazwa próby	Założona wartość tylozyny	Masa odważki, g	Objętość pobranego supernatantu, ml	Rozcieńczenie do objętości, ml
Prepare	100 g/kg	1	1	100*)
Premiks	5 g/kg	4	1	100
	4 g/kg	5	1	50
Koncentrat	200 mg/kg	10	5	50
Mieszanka	100 mg/kg	20	5	50
	40 g/kg	20	5	20
*) pobrać 5 ml i rozcieńczyć do objętości 50 ml

 

Rozdział 7

BADANIE KOKCYDIOSTATYKÓW I INNYCH ŚRODKÓW FARMACEUTYCZNYCH

7.1. OZNACZANIE ETOPABATU

(metylo-4-acetamido-2-etoksybenzoesan)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do ilościowego oznaczania etopabatu w paszach, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 2 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbę ekstrahuje się rozcieńczonym metanolem. Roztwór zakwasza się i ekstrahuje chloroformem. Ekstrakt chloroformowy przemywa się początkowo roztworem alkalicznym, a następnie wodą. Po przemyciu i zagęszczeniu ekstrakty hydrolizuje się rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Po wywołaniu reakcji barwnej przez dwuazowanie i dodanie 2-aminoetyl-l-naftylominą powstały barwny kompleks ekstrahuje się butanolem i mierzy absorbancję roztworu przy 555 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Metanol

3.2. Metanol 50% (V/V): wymieszać równe objętości metanolu (3.1) i wody

3.3. Kwas chlorowodorowy, d = 1,19 g/ml

3.4. Kwas chlorowodorowy rozcieńczony dziesięciokrotnie: rozcieńczyć 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) wodą do 100 ml.

3.5. Kwas chlorowodorowy około 0,3 mol/l (0,3 N): rozcieńczyć 25 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) wodą do 1.000 ml

3.6. Chloroform

3.7. Węglan sodu, roztwór 4% (m/v). Rozpuścić 40,0 g bezwodnego węglanu sodu w wodzie, dopełnić wodą do 1.000 ml i wymieszać.

3.8. Azotyn sodu, roztwór 0,2% (w/v). Rozpuścić 100 mg azotynu sodu w wodzie w 50 ml kolbie miarowej, uzupełnić do kreski i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.9. Amidosulfanian amonowy, roztwór 1% (m/v). Rozpuścić 500 mg amidosulfanianu amonowego w wodzie w 50 ml kolbie miarowej, dopełnić do kreski i wymieszać. Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.10. 2-aminoetylo-1-naftyloamina, roztwór 0,2% (m/v). Rozpuścić 100 mg 2-aminoetylo-1-naftyloaminy w 50 ml wody, dopełnić do 50 ml i wymieszać. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.11. Chlorek sodu bezwodny

3.12. N-butanol

3.13. Substancja wzorcowa: czysty etopabat

3.14. Roztwory wzorcowe:

3.14.1. Roztwór o zawartości 0,040 mg etopabatu w 1 ml. Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 40 mg substancji wzorcowej (3.13). Rozpuścić w 100 ml metanolu (3.2) w kolbie miarowej, wymieszać. 10 ml uzyskanego roztworu rozcieńczyć metanolem do 100 ml w kolbie miarowej i wymieszać. Rozcieńczyć 10,0 ml do 100 ml metanolem (3.2) w kolbie miarowej i zamieszać. Roztwór nadaje się do użycia przez 1 miesiąc od sporządzenia.

3.14.2. Roztwór o zawartości 0,016 mg etopabatu w 20 ml. Rozcieńczyć 5,0 ml roztworu (3.14.1) metanolem (3.2) w kolbie miarowej o pojemności 250 ml, uzupełnić do kreski i dobrze wymieszać. Przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolba stożkowa o pojemności 250 ml ze szklanym korkiem

4.2. Rozdzielacz o pojemności 100 ml ze szklanym korkiem

4.3. Wstrząsarka

4.4. Obrotowy odparowywacz próżniowy z kolbami o pojemności 250 ml

4.5. Łaźnia wodna

4.6. Wirówka, 50 ml i 15 ml probówki wirówkowe zamykane korkami szklanymi

4.7. Szklana chłodnica powietrzna ze szlifem

4.8. Spektrofotometr z kuwetami o 10 mm warstwie pomiarowej

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, taką ilość rozdrobnionej i homogennej próbki, która zawiera około 80 µg etopabatu. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml (4.1) i dodać 100 ml rozcieńczonego metanolu (3.2). Wymieszać, zakorkować kolbę i wstrząsać przez 1 godzinę na wstrząsarce (4.3). Zdekantować, przesączyć i odrzucić pierwsze mililitry przesączu.

5.2. Oczyszczanie

Wszystkie poniższe czynności należy wykonywać szybko.

W rozdzielaczu (4.2) o pojemności 100 ml umieścić 20 ml klarownego ekstraktu, dodać 5 ml rozcieńczonego 10-krotnie kwasu chlorowodorowego (3.4) i 20 ml chloroformu (3.6) i wstrząsać przez 3 minuty, początkowo ostrożnie, a następnie energicznie. Pozostawić do rozdzielenia faz, a następnie fazę chloroformową umieścić w drugim rozdzielaczu również o pojemności 100 ml (4.2).

Fazę kwaśną ekstrahować jeszcze dwa razy 20 ml porcjami chloroformu (3.6). Dołączyć fazy chloroformowe do fazy znajdującej się już w drugim rozdzielaczu i odrzucić fazę kwaśną. Do roztworu chloroformowego dodać 10 ml roztworu węglanu sodu (3.7), wstrząsać przez trzy minuty i pozostawić do rozdzielenia faz. Zebrać fazę chloroformową do czwartego 100 ml rozdzielacza (4.2), przemyć dwukrotnie 25 ml porcjami wody, oddzielić fazy wodne i przenieść ilościowo ekstrakt chloroformowy do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (4.4). Fazy wodne połączyć razem w jednym rozdzielaczu (za każdym razem opróżniony rozdzielacz przemyć kilkoma ml chloroformu), przemyć fazę wodną taką samą ilością chloroformu; pozostawić fazy do rozdzielenia, dołączyć fazę chloroformową do ekstraktu chloroformowego zebranego w kolbie.

5.3. Hydroliza

Odparować chloroformowy ekstrakt do około 2 ml na obrotowym odparowywaczu próżniowym (4.4) w temperaturze łaźni wodnej 50°C. Pozostałość rozpuścić w 2 do 3 ml metanolu (3.1) i przenieść ilościowo do 50 ml probówki wirówkowej (4.6), stosując dwukrotnie 10 ml i jednokrotnie 5 ml kwasu chlorowodorowego 0,3 mol/l (3.5). Umocować chłodnicę (4.7) nad probówką i wrzucić kilka porcelanek, dobrze wstrząsnąć, zanurzyć probówkę wirówkową we wrzącej wodzie, ogrzewać przez 45 minut. Probówkę schłodzić w strumieniu zimnej wody.

5.4. Wywołanie reakcji barwnej, pomiar absorbancji

Dodać 1 ml roztworu azotynu sodu (3.8), zamieszać i pozostawić na 2 minuty. Dodać 1 ml roztworu 2-aminoetylo-2-naftyloaminy (3.10), zamieszać i pozostawić na 10 minut. Dodać 1 ml roztworu amidosulfanianu (3.9) i pozostawić na 2 minuty. Dodać 5 g chlorku sodu (3.11) i 10 ml n-butanolu, mocno wstrząsać aż do całkowitego rozpuszczenia soli. Odpipetować fazę butanolową i umieścić w 15 ml probówce wirówkowej (4.6), odwirować. Zmierzyć absorbancję E_A roztworu na spektrofotometrze przy 555 nm, używając n-butanolu jako roztworu odniesienia.

5.5. Próba kontrolna

Stosując tę samą procedurę począwszy od (5.2), przeprowadzić test kontrolny, używając 20 ml rozcieńczonego metanolu (3.2). Zmierzyć absorbancję przy 555 nm wobec butanolu jako roztworu odniesienia - E_B (3.12).

5.6. Próba wzorcowa

Stosując tę samą procedurę począwszy od (5.2), przeprowadzić test, używając 20 ml roztworu wzorcowego (3.14.2). Zmierzyć absorbancję E_c przy 555 nm wobec n-butanolu (3.12) jako roztworu odniesienia.

 

   (E_a - E_b) x 80

x = ---------------,

   (E_c - E_b) x m

gdzie:

x -   zawartość etopabatu, w mg/kg,

E_a -  absorbancja roztworu próby badanej,

E_b -  absorbancja ślepej próby,

E_c -  absorbancja roztworu wzorcowego,

m -   odważka próbki analitycznej, w g.

6. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Dopuszczalne różnice między dwoma powtórzeniami nie mogą przekroczyć następujących wartości:

-   20% wartości względnej dla zawartości etopabatu poniżej 7,5 mg/kg,

-   1,5 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 7,5 do 10 mg/kg,

-   15% wartości względnej dla zawartości powyżej 10 mg/kg.

7.2. OZNACZANIE METYLOBENZOQUATU

(7-benzyloksy-6-butylo-3-metoksykarbonylo-4-chinolon)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości metylobenzoquatu w paszach. Dolna granica oznaczalności metody wynosi 1 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Metylobenzoquat ekstrahuje się z próby alkoholowym roztworem kwasu metanosulfonowego. Ekstrakt oczyszcza się dichlorometanem przy wykorzystaniu chromatografii jonowymiennej, a następnie ponownie dichlorometanem. Zawartość metylobenzoquatu oznacza się za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Dichlorometan

3.2. Metanol, czysty do HPLC

3.3. Faza ruchoma HPLC:

mieszanina metanolu (3.2) i wody (czystej do HPLC) 75 + 25 (V/V)

Przesączyć roztwór przez sączek o porach 0,22 µm (4.5) i odgazować roztwór (np. poddając roztwór działaniu ultradźwiękami przez 10 minut).

3.4. Roztwór kwasu metanosulfonowego, 2%

20,0 ml kwasu metanosulfonowego rozcieńczyć metanolem (3.2) do objętości 1.000 ml.

3.5. Roztwór kwasu chlorowodorowego, 10%

100 ml kwasu chlorowodorowego (P₂₀ c. 1,18 g/ml) rozcieńczyć wodą do objętości 1.000 ml.

3.6. Żywica jonowymienna Amberlit CG-120 (Na), 100 do 200 mesh

Przygotowanie żywicy: zalać 100 g żywicy 500 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5) i ogrzewać do wrzenia, ciągle mieszając. Po ochłodzeniu kwas zdekantować. Pozostałość odsączyć na sączku z bibuły przy użyciu próżni. Żywicę przemyć dwukrotnie 500 ml porcjami wody, a następnie 250 ml metanolu (3.2). Przemyć ponownie żywicę 250 ml metanolu i wysuszyć, przepuszczając powietrze przez warstwę żywicy na sączku. Żywicę przechowywać w suchej, zakorkowanej butelce.

3.7. Substancja wzorcowa: czysty metylobenzoquat

3.7.1. Podstawowy roztwór wzorcowy metylobenzoquatu, 500 µg/ml

Odważyć 50 mg substancji wzorcowej (3.7), z dokładnością do 0,1 mg, i przenieść do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w roztworze kwasu metanosulfonowego (3.4), uzupełnić do kreski i zamieszać.

3.7.2. Pośredni rozwór wzorcowy metylobenzoquatu, 50 µg/ml

Do kolby miarowej o pojemności 50 ml przenieść 5 ml podstawowego roztworu wzorcowego metylobenzoquatu (3.7.1), uzupełnić zawartość do kreski metanolem (3.2) i wymieszać.

3.7.3. Roztwory wzorcowe do kalibracji

Do pięciu kolb miarowych o pojemności 25 ml przenieść kolejno 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 i 5,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego metylobenzoquatu (3.7.2). Uzupełnić zawartość do kreski fazą ruchomą (3.3) i wymieszać. Roztwory te zawierają odpowiednio 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 i 10,0 µg/ml metylobenzoquatu. Roztwory przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Wstrząsarka laboratoryjna

4.2. Obrotowy odparowywacz próżniowy

4.3. Kolumna szklana (250 mm x 15 mm) z kranem i zbiornikiem o pojemności około 200 ml

4.4. Wyposażenie do HPLC z detektorem UV o zmiennej długości fali pomiarowej lub z detektorem diodowym

4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej: 300 mm x 4 mm, C₁₈, wypełnienie 10 µm lub podobne

4.5. Filtry membranowe, 0,22 µm

4.6. Filtry membranowe, 0,45 µm

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Poddać analizie ślepą próbkę paszy celem potwierdzenia, że nie zawiera metylobenzoquatu ani substancji interferujących.

5.1.2. Należy przeprowadzić badanie odzysku, analizując ślepą próbę paszy z dodatkiem znanej ilości metylobenzoquatu, podobnej do ilości, jaka znajduje się w analizowanej próbce. Aby wzbogacić paszę w metylobenzoquat na poziomie 15 mg/kg, należy dodać 600 µl wzorcowego roztworu podstawowego (3.7.1) do 20 g ślepej próby paszy, wymieszać i odczekać 10 minut do rozpoczęcia ekstrakcji (5.2).

Ślepa próba paszy powinna być podobnego typu do analizowanej próbki, a jej analiza nie powinna stwierdzać obecności metylobenzoquatu.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć około 20 g przygotowanej próby z dokładnością do 0,01 g. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 100 ml roztworu kwasu metanosulfonowego (3.4.) i wstrząsać mechanicznie (4.2) przez 30 minut. Roztwór przesączyć przez sączek z bibuły i następnie przesączu użyć do rozdziału w układzie ciecz - ciecz.

5.3. Rozdział w układzie ciecz - ciecz

Do rozdzielacza o pojemności 500 ml zawierającego 100 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5) wprowadzić 25 ml otrzymanego wcześniej przesączu (5.2). Dodać 100 ml dichlorometanu (3.1) i wstrząsać przez 1 minutę. Pozostawić do rozdzielenia się warstw, a następnie dolną warstwę (dichlorometanową) spuścić do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję dwukrotnie, dodając do warstwy wodnej 40 ml dichlorometanu. Oddzieloną warstwę dolną połączyć z ekstraktem znajdującym się w kolbie okrągłodennej. Odparować ekstrakt do sucha na obrotowym odparowywaczu próżniowym (4.2) pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C. Pozostałość rozpuścić w 20 do 25 ml metanolu (3.2), zamknąć kolbę i pozostawić całą zawartość do chromatografii jonowymiennej (5.4).

5.4. Chromatografia jonowymienna

5.4.1. Przygotowanie kolumny z kationitem

Dolny koniec kolumny zamknąć korkiem z waty szklanej (5.4). Przygotować zawiesinę 5 g żywicy kationitowej (3.6) w 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.5). Wlać ją do kolumny i pozostawić do ustabilizowania się. Spuścić nadmiar kwasu znad powierzchni żywicy i przemywać kolumnę wodą do obojętnego odczynu wycieku wobec lakmusu. Przez kolumnę przepuścić 50 ml metanolu i poczekać, aż wypełni żywicę.

5.4.2. Chromatografia kolumnowa

Przesącz otrzymany w punkcie (5.3) nanieść ostrożnie pipetą na kolumnę. Kolbę okrągłodenną przemyć dwukrotnie porcjami 5 - 10 ml metanolu (3.2), a następnie roztwór z przemycia nanieść na kolumnę. Ekstrakt przepuścić przez kolumnę, następnie przemyć ją 50 ml metanolu przy przepływie nie większym niż 5 ml na minutę. Wyciek odrzucić. Metylbenzoquat wymyć z kolumny za pomocą 150 ml roztworu kwasu metanosulfonowego (3.4) i zebrać eluat w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml.

5.5. Rozdział w układzie ciecz - ciecz

Eluat otrzymany w punkcie (5.4.2) przenieść do 1-litrowego rozdzielacza. Przemyć kolbę stożkową 5 - 10 ml metanolu (3.2) i roztwór po przemyciu dołączyć do zawartości rozdzielacza. Dodać 300 ml roztworu kwasu chlorowodorowego (3.5) i 130 ml dichlorometanu (3.1). Wstrząsać 1 minutę i pozostawić do rozdzielenia faz. Dolną warstwę (dichlorometan) przenieść do kolby okrągłodennej o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję fazy wodnej następnymi dwoma porcjami 70 ml dichlorometanu i ekstrakty dołączyć do zawartości pierwszej kolby okrągłodennej.

Ekstrakt odparować do sucha na obrotowym odparowywaczu próżniowym (4.2) przy zmniejszonym ciśnieniu w temperaturze 40°C. Pozostałość rozpuścić w około 5 ml metanolu (3.2) i roztwór przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 10 ml. Przemyć dwa razy kolbę porcjami 1 do 2 ml metanolu i roztwór po przemyciu przenieść do kolby. Dopełnić metanolem do kreski i wymieszać. Część roztworu przesączyć przez filtr membranowy (4.6). Roztwór zachować do oznaczania HPLC (5.6).

5.6. Oznaczanie HPLC

5.6.1. Parametry

Poniższe warunki podano dla przykładu. Można zastosować inne parametry pod warunkiem, że uzyskuje się równoważne wyniki:

-   kolumna do chromatografii cieczowej (4.4.1),

-   faza ruchoma do HPLC: mieszanina metanolu z wodą (3.3),

-   przepływ: od 1 do 1,5 ml/min,

-   długości fali pomiarowej detektora: 265 nm,

-   objętość dozowania: od 20 do 50 µl.

Sprawdzić stabilność układu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny (3.7.3) zawierający 4 µg/ml aż do ustalenia stałych wysokości lub powierzchni pików oraz czasów retencji.

5.6.2. Krzywa kalibracyjna

Dozować każdy z wzorcowych roztworów kalibracyjnych (3.7.3) kilka razy i zmierzyć wysokości (powierzchnie) pików dla każdego stężenia. Sporządzić krzywą zależności, umieszczając średnie wysokości lub powierzchnie pików na osi rzędnych, a odpowiadające im stężenia w µg/ml na osi odciętych.

5.6.3. Badany roztwór próbki

Dozować kilkakrotnie taką samą objętość ekstraktu próbki (5.5), jaką brano przy roztworach kalibracyjnych i wyznaczyć średnią wysokość lub powierzchnię piku metylobenzoquatu.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Stężenie metylobenzoquatu (µg/ml) w roztworze próbki badanej odczytać z wykresu, przyporządkowując zmierzonej wysokości piku odpowiednie stężenie (5.6.2). Zawartość metylobenzoquatu w (mg/kg) w próbce obliczyć według następującego wzoru:

    c x 40

w = ---------,

      m

w którym:

c -  stężenie metylobenzoquatu w roztworze próbki wyrażone w ng/ml, odczytane z wykresu,

m -  masa badanej próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Sprawdzanie tożsamości

Tożsamość przeprowadzonej zanalizowanej substancji można potwierdzić na drodze kochromatografii lub przy użyciu detektora diodowego, porównując spektra ekstraktu próbki z roztworem kalibracyjnym zawierającym 10 µg/ml metylobenzoquatu.

7.1.1. Kochromatografia

Ekstrakt próbki wzbogacić dodatkiem odpowiedniej ilość pośredniego roztworu wzorcowego (3.7.2). Ilość dodanego metylobenzoquatu powinna być porównywalna z ilością metylobenzoquatu w ekstrakcie próbki.

Tylko wysokość piku metylobenzoquatu może wzrosnąć, odpowiednio do dodanej ilości i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie wysokości nie powinna przekraczać około 10% pierwotnej szerokości.

7.1.2. Użycie detektora diodowego.

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

(a)  Długość fali odpowiadająca maksymalnej absorpcji widma próbki i wzorca w punkcie wierzchołka piku zarejestrowanego na chromatogramie powinna być taka sama, po uwzględnieniu marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcyjnego. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm.

(b)  W zakresie pomiędzy 220 a 350 nm widma próbki i wzorca w punkcie wierzchołka piku na chromatogramie nie powinny się różnić więcej niż w zakresie od 10 do 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują te same maksima i nie obserwuje się punktów rozbieżności pomiędzy dwoma widmami większych niż 15% absorbancji wzorcowego roztworu.

(c)  W zakresie od 220 do 350 nm odcinki wzrostu, maksimum i spadku piku próbki i wzorca nie powinny się różnić więcej niż od 10 do 100% absorbancji względnej. Kryterium to jest spełnione, jeśli na spektrum obecne są te same piki, a różnice między spektrami dla wszystkich obserwowanych punktów nie przekraczają 15% absorbancji wierzchołka.

Jeśli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność oznaczanej substancji nie została potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Dopuszczalna różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać: 10% wartości błędu względnego w stosunku do wyższego wyniku zawartości metylobenzoquatu w zakresie od 4 do 20 mg/kg.

7.3. Odzysk

Odzysk metylobenzoquatu z wzbogaconej ślepej próbki nie może być mniejszy niż 90%.

7.3. OZNACZANIE NIKARBAZYNY

(równomolowa mieszanina 4,4-dinitrokarbanilidu i 2-hydroksy-4,6-dimetylopirymidyny)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania nikarbazyny w premiksach, koncentratach i mieszankach paszowych, niezawierających więcej niż 5% mączki z traw. Pochodne nitrofuranu, acetylenoheptyny i karbadoksu mogą interferować. Dolna granica wykrywalności metody wynosi 20 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbę ekstrahuje się N,N-dimetyloformamidem, ekstrakt oczyszcza na kolumnie z tlenkiem glinowym, a nikarbazyna jest eluowana etanolem. Eluat traktuje się etanolowym roztworem wodorotlenku sodu i powstaje żółte zabarwienie. Nikarbazyna jest oznaczana spektrofotometrycznie przy 430 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. N,N-dimetyloformamid

3.2. Tlenek glinowy do chromatografii kolumnowej: tlenek glinowy wyprażyć co najmniej przez 2 godziny w temperaturze 750°C, ochłodzić w eksykatorze i przechowywać w butli ze szkła oranżowego z korkiem szklanym. Sprawdzić aktywność tlenku glinowego, rozpoczynając proces od (5.2), oznaczając nikarbazynę w roztworze wzorcowym (3.8.3). Stopień odzysku nikarbazyny powinien wynosić 100% ± 2%.

3.3. Etanol, 95% (V/V)

3.4. Etanol, 80% (V/V)

3.5. Wodorotlenek sodu, roztwór 50% (w/v)

3.6. 1% roztwór wodorotlenku sodu w etanolu (w/v): 1 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.5) umieścić w kolbie miarowej o pojemności 50 ml i uzupełnić 80% etanolem do kreski (3.4). Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.7. Wzorzec nikarbazyny o molowej absorbancji w N,N-dimetyloformamidzie przy 362 nm = 37,8 x 10³.

3.8. Roztwory wzorcowe

3.8.1. Podstawowy roztwór wzorcowy nikarbazyny o stężeniu 1,25 mg/ml: 125 mg substancji wzorcowej (3.7) odważyć z dokładnością do 0,1 mg i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml, dodać 75 ml dimetyloformamidu (3.1) i lekko podgrzać. Po rozpuszczeniu schłodzić, uzupełnić objętość do kreski tym samym rozpuszczalnikiem i zamieszać. Chronić przed światłem.

3.8.2. Roboczy roztwór wzorcowy nikarbazyny o stężeniu 0,125 mg/ml: rozcieńczyć 10 ml podstawowego roztworu wzorcowego nikarbazyny (3.8.1) w kolbie miarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do kreski dimetyloformamidem (3.1) i zamieszać.

3.8.3. Roboczy roztwór nikarbazyny o stężeniu 0,025 mg/ml, odpipetować 20 ml roboczego roztworu wzorcowego (3.8.2) i umieścić w kolbie miarowej o pojemności 100 ml. Następnie uzupełnić zawartość dimetyloformamidem do kreski i zamieszać.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolba stożkowa ze szklanym korkiem, o pojemności 250 ml

4.2. Chłodnica zwrotna ze szlifem

4.3. Wrząca łaźnia wodna

4.4. Wirówka z probówkami o pojemności 120 ml

4.5. Szklana kolumna chromatograficzna (średnica wewnętrzna 25 mm, długość 300 mm)

4.6. Spektrofotometr z kuwetami o 10 mm grubości warstwy pomiarowej

4.7. Biureta z podziałką w zakresie 1/10 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja

Z bardzo rozdrobnionej i homogennej próby odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g odważkę mieszanki paszowej lub 1 g odważkę premiksu do kolby stożkowej ze szlifem, o pojemności 250 ml, dodać ściśle 100 ml N,N-dimetyloformamidu (3.1) i wymieszać. Kolbę umieścić pod chłodnicą zwrotną (4.2) i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej (4.3) przez 15 minut, od czasu do czasu wstrząsając zawartość. Kolbę oziębić w strumieniu zimnej wody. Zawartość przenieść do probówki wirówkowej i wirować przez 3 minuty. Jeśli zajdzie potrzeba, pobrać 25 ml roztworu i rozcieńczyć N,N-dimetyloformamidem (3.1) tak, ażeby 1 ml roztworu zawierał od 2 do 10 µg nikarbazyny.

5.2. Chromatografia

Do kolumny chromatograficznej (4.5) wprowadzić 30 g zawiesiny tlenku glinowego (3.2) w N,N-dimetyloformamidzie (3.1). Nadmiar N,N-dimetyloformamidu wypuścić z kolumny i kiedy lustro cieczy będzie na wysokości 1 cm ponad warstwą tlenku glinowego, na kolumnę nanieść 25 ml ekstraktu otrzymanego według (5.1). Wypuścić z kolumny ciecz, nie dopuszczając do wysuszenia wypełnienia, a następnie kolumnę przemyć trzykrotnie 10 ml porcjami N,N-dimetyloformamidu. W końcu eluować kolumnę 70 ml etanolu o stężeniu 95% (V/V). Pierwsze 10 ml eluatu odrzucić, dalszy eluat zebrać w kolejnych frakcjach:

frakcja (a) - 5 ml,

frakcja (b) - 50 ml w kolbie miarowej,

frakcja (c) - 5 ml.

Sprawdzić, czy frakcje (a) i (c) nie dają żółtego zabarwienia z etanolowym roztworem wodorotlenku sodu (3.6). W dalszym ciągu procesu analitycznego używać frakcji (b).

5.3. Wywołanie barwy i pomiar absorbancji

Do dwu kolb miarowych A i B o pojemności 25 ml wprowadzić pipetą po 20 ml frakcji (b) eluatu. Do kolby A dodać 5 ml etanolowego roztworu wodorotlenku sodu (3.6), do kolby B zaś 5 ml 95% etanolu(3.3). Zawartość kolb wymieszać i po 5 minutach zmierzyć absorbancję obu roztworów przy 430 nm wobec mieszaniny 20 ml 95% etanolu (3.3) z 5 ml etanolowego roztworu wodorotlenku sodu (3.6). Wartość absorbancji roztworu B odjąć od absorbancji roztworu A. Z krzywej wzorcowej (5.4) odczytać zawartość nikarbazyny.

5.4. Kalibracja

25 ml roboczego roztworu nikarbazyny (3.8.3) przeprowadzić przez kolumnę chromatograficzną według (5.2). Z frakcji (b) za pomocą biurety (4.7) odmierzyć 2, 4, 6, 8 i 10 ml porcje eluatu, zawierające odpowiednio 0,025; 0,050; 0,075; 0,100 i 0,125 mg nikarbazyny, do serii kolb miarowych o pojemności 25 ml. Do kolb dodać po 5 ml etanolowego roztworu wodorotlenku sodu (3.6), uzupełnić kolbę do kreski 95% etanolem (3.3) i wymieszać. Po 5 minutach zmierzyć absorbancję uzyskanych roztworów przy 430 nm wobec 20 ml mieszaniny 95% etanolu (3.3) i 5 ml etanolowego roztworu wodorotlenku sodu (3.6). Wykreślić krzywą wzorcową, umieszczając na osi rzędnych absorbancję, na osi odciętych zawartość nikarbazyny w mg.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość nikarbazyny, w mg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

x = A/W x F x 10.000,

w którym:

A -   zawartość nikarbazyny odczytana z krzywej wzorcowej według (5.4),

F -   współczynnik rozcieńczenia (5.1),

W -   odważka próby, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie powinnna przekraczać:

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej przy zawartości nikarbazyny poniżej 100 mg/kg,

-   10% wartości względnej przy zawartości od 100 do 5.000 mg/kg,

-   500 mg/kg wartości bezwzględnej przy zawartości od 5.000 do 10.000 mg/kg,

-   5% wartości względnej przy zawartości powyżej 10.000 mg/kg nikarbazyny.

7.4. OZNACZANIE HALOFUGINONU

(dl-trans-7-bromo-6-chloro-3-[3-(3-hydroksy-2-piperydylo)acetonylo]-chinazoliny-4-(3H)-jeden bromowodorek)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości halofuginonu w paszach o zawartości tego składnika powyżej 1 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Po potraktowaniu gorącą wodą, halofuginon ekstrahuje się w postaci wolnej do octanu etylowego, a częściowo jako chlorowodorek do wodnego roztworu kwasu chlorowodorowego. Ekstrakt oczyszcza się przy wykorzystaniu chromatografii jonowymiennej, zawartość halofuginonu określa się za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconą fazą (HPLC) oraz przy użyciu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Acetonitryl czystości do HPLC

3.2. Żywica Amberlite XAD-2

3.3. Octan amonu

3.4. Octan etylowy

3.5. Lodowaty kwas octowy

3.6. Wzorzec halofuginonu

3.6.1. Podstawowy roztwór halofuginonu, 100 µg/ml: odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg halofuginonu (3.6). Przenieść do kolby miarowej o pojemności 500 ml i rozpuścić w buforze z octanem amonu (3.18). Uzupełnić kolbę do kreski buforem i wymieszać. Roztwór jest stabilny przez 3 tygodnie pod warunkiem, że jest przechowywany bez dostępu światła w zakorkowanym naczyniu.

3.6.2. Roztwory wzorcowe kalibracyjne

Do szeregu kolb miarowych o pojemności 100 ml odpipetować kolejno 1, 2, 3, 4 i 6 ml podstawowego roztworu halofuginonu (3.6.1). Po uzupełnieniu zawartości kolb do kreski fazą ruchomą (3.21) wymieszać. Roztworom tym odpowiadają następujące stężenia halofuginonu 1, 2, 3, 4 i 6 µg/ml. Roztwory przygotować bezpośrednio przed użyciem.

3.7. Kwas chlorowodorowy (r₂₀ ok. 1,16 g/ml)

3.8. Metanol

3.9. Azotan srebra

3.10. Askorbinian sodu

3.11. Węglan sodu

3.12. Chlorek sodu

3.13. EDTA (etylenodiaminoczterooctowy kwas, sól disodowa)

3.14. Woda czystości do HPLC

3.15. Roztwór węglanu sodu, s = 10 g/100 ml

3.16. Roztwór chlorku sodu wysycony węglanem sodu, 5g/100 ml

Rozpuścić 50 g węglanu sodu (3.11) w wodzie, rozcieńczyć do 1l i dodawać chlorek sodu (3.12) aż do otrzymania roztworu nasyconego.

3.17. Kwas chlorowodorowy, stężenie ok. 0,1 mol/l. Rozcieńczyć 10 ml HCL (3.7) wodą do 1 litra.

3.18. Roztwór buforu octanu amonu, ok. 0,25. Rozpuścić 19,3 g octanu amonu (3.3) i 30 ml kwasu octowego (3.5) w wodzie (3.14) i rozcieńczyć do 1l.

3.19. Przygotowanie żywicy Amberlit XAD-2

Żywicę przemywać wodą do zaniku chlorków, co sprawdza się azotanem srebra (3.20) w odrzucanej fazie wodnej. Następnie przemyć żywicę 50 ml metanolu (3.8), odrzucając metanol z przemycia. Żywicę przechowywać pod świeżym metanolem.

3.20. Roztwór azotanu srebra ok. 0,1 mol/l

Rozpuścić 0,17 g azotanu srebra (3.9) w 10 ml wody.

3.21. Faza ruchoma do HPLC

Zmieszać 500 ml acetonitrylu (3.1) z 300 ml buforowego octanu amonu (3.18) i 1.200 ml wody (3.14). Ustawić pH na 4,3 za pomocą kwasu octowego (3.5). Przesączyć przez sączek o porach 0,22 µm (4.8), a następnie odgazować roztwór (np. na łaźni ultradźwiękowej przez 10 minut). Roztwór jest stabilny przez miesiąc pod warunkiem, że jest przechowywany z dala od światła, w szczelnie zamkniętym naczyniu.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Łaźnia ultradźwiękowa

4.2. Obrotowy odparowywacz próżniowy

4.3. Wirówka

4.4. Wyposażenie do HPLC z detektorem UV o zmiennej długości fali bądź z detektorem diodowym

4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 300 mm x 4 mm, C₁₈, upakowana ziarnem 10 µm, lub jej odpowiednik

4.5. Kolumna szklana (300 mm x 10 mm) z kranem i ze spiekiem

4.6. Filtry z włóknem szklanym o średnicy 150 mm

4.7. Filtry membranowe 0,45 µm

4.8. Filtry membranowe 0,22 µm

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Halofuginon w wolnej formie jest niestabilny zarówno w roztworze zasadowym, jak i w octanie etylowym. Nie powinien pozostawać w octanie etylu dłużej niż 30 minut.

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próba nie powinna zawierać ani halofuginonu, ani innych substancji interferujących.

5.1.2. Należy przeprowadzić test na odzysk, analizując ślepą próbę (5.1.1) z dodatkiem znanej ilości halofuginonu i podobnej do ilości obecnej w próbie. Wzbogacenie na poziomie 3 mg/kg uzyskuje się, dodając 300 µl roztworu podstawowego (3.6.1) do 10 g ślepej próby. Po wymieszaniu i odczekaniu 10 minut rozpocząć ekstrakcję według (5.2).

5.1.3. Rodzaj ślepej próby powinien być podobny do rodzaju próbki analizowanej.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,1 g, 10 g przygotowanej próbki i umieścić w probówce wirówkowej o pojemności 200 ml. Dodać 0,5 g askorbianu sodu (3.10), 0,5 g EDTA (3.13), 20 ml wody i wszystko wymieszać. Probówkę umieścić na 5 minut w łaźni wodnej (80°C). Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodać 20 ml roztworu węglanu sodu (3.15) i wymieszać. Niezwłocznie dodać 100 ml octanu etylowego (3.4) i ręcznie, energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Następnie umieścić probówkę w łaźni ultradźwiękowej (4.1), odkorkować. Wirować przez dwie minuty, zdekantować fazę octanu etylowego i przesączyć przez sączek z włóknem szklanym (4.6) do rozdzielacza o pojemności 500 ml. Powtórzyć ekstrakcję drugą porcją 100 ml octanu etylowego. Przemywać połączone ekstrakty przez minutę 50 ml roztworu chlorku sodu nasyconego węglanem sodu (3.16) i zdekantować warstwę wodną.

Fazę organiczną ekstrahować przez minutę 50 ml kwasu chlorowodorowego (3.17). Dolną kwasową warstwę spuścić do rozdzielacza o pojemności 250 ml. Przez kolejne 1,5 minuty powtarzać ekstrakcję warstwy organicznej 50 ml kwasu chlorowodorowego i ekstrakt połączyć z ekstraktem uzyskanym z pierwszego procesu. Przemyć połączone ekstrakty, wirując z 10 ml octanu etylowego (3.4) przez 10 sekund.

Fazę organiczną odrzucić, a fazę wodną przenieść ilościowo do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Znajdujący się jeszcze w roztworze kwasu octan etylowy odparować na obrotowym odparowywaczu próżniowym (2.4). Temperatura wody w łaźni nie powinna przekraczać 40°C. Przy podciśnieniu ok. 25 milibarów cały pozostający jeszcze octan etylu odparuje w ciągu 5 minut w temperaturze 38°C.

5.3. Oczyszczanie

5.3.1. Przygotowanie kolumny z Amberlitem

Dla każdej próbki ekstraktu przygotować kolumnę z żywicą XAD.2. 10 g przygotowanego Amberlitu (3.18) umieścić w szklanej kolumnie (4.5) za pomocą metanolu (3.8). Nad żywicą umieścić korek z waty szklanej. Przepuścić metanol przez kolumnę, a następnie przemyć żywicę 100 ml wody, zatrzymując proces w momencie, gdy ciecz dosięgnie wierzchołka żywicy. Pozostawić kolumnę do ustabilizowania na 10 minut przed użyciem. Nie dopuścić do osuszenia kolumny.

5.3.2. Oczyszczanie próbki

Ekstrakt uzyskany w (5.2) nanieść ilościowo na kolumnę z Amberlitem (5.3.1) i eluować, odrzucając eluat. Szybkość elucji nie powinna przekraczać 20 ml/min. Przemyć kolbę okrągłodenną 20 ml porcją kwasu chlorowodorowego (3.17), roztwór z przemycia wykorzystać następnie do przemycia żywicy. Przedmuchać resztki pozostającego kwaśnego roztworu strumieniem powietrza. Wylać roztwór po przemyciu, nanieść 100 ml metanolu (3.8) na kolumnę, zebrać 5 do 10 ml eluatu w 250 ml kolbie okrągłodennej. Pozostający jeszcze na kolumnie metanol zebrać po 10 minutach do tej samej kolby okrągłodennej, kontynuując elucję przy ustalonym przepływie 20 ml/min. Na obrotowym odparowywaczu próżniowym (4.2) odparować metanol przy temperaturze wody w łaźni nie wyższej niż 40°C. Za pomocą fazy ruchomej (13.21) przenieść ilościowo pozostałość do 10 ml kolby miarowej. Uzupełnić kolbę fazą ruchomą do kreski i wymieszać. Ciecz przesączyć przez filtr membranowy (4.7). Roztworu użyć do oznaczeń metodą HPLC.

5.4. Oznaczenie przez HPLC

5.4.1. Parametry

Poniższe warunki podano dla przykładu. Można zastosować inne parametry pod warunkiem, że uzyskuje się równoważne wyniki.

-   kolumna do chromatografii cieczowej (4.4.1)

-   faza ruchoma do HPLC (3.21)

-   przepływ: od 1,5 do 2 ml/min

-   długość fali: 265 nm

-   objętość dozowania: od 40 do 100 µl

Sprawdzić stabilność układu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny o stężeniu 3,0 µg/ml, aż do ustabilizowania wysokości lub powierzchni pików oraz czasów retencji.

5.4.2. Krzywa kalibracyjna

Każdy z wzorcowych roztworów zadozować (3.6.2) kilka razy i zmierzyć wysokości (powierzchnie) pików dla każdego stężenia. Sporządzić krzywą zależności średnich wysokości lub powierzchni pików od odpowiednich stężeń w µg/ml wzorcowych roztworów kalibracyjnych. Sporządzić krzywą kalibracyjną. Na osi odciętych umieścić stężenia roztworów kalibracyjnych (3.7.3) w µg/ml, a na osi rzędnych odpowiadające im średnie wysokości lub powierzchnie pików.

5.4.3. Roztwór badany

Zadozować kilkakrotnie taką samą objętość ekstraktu próbki (5.3.2), jaką brano przy roztworach kalibracyjnych i wyznaczyć średnią wysokość lub powierzchnię piku halofuginonu.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Stężenie halofuginonu (µg/ml) w roztworze próbki badanej odczytujemy z wykresu, przyporządkowując zmierzonej wysokości piku odpowiednie stężenie (5.4.2). Zawartość halofuginonu (w mg/kg) w próbce obliczamy według następującego wzoru:

W = c x 10/m,

w którym:

c -  stężenie halofuginonu w roztworze próbki, wyrażone w µg/ml (odczytane z wykresu kalibracyjnego),

m -  masa odważki próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Sprawdzanie tożsamości

Tożsamość przeprowadzonej zanalizowanej substancji można potwierdzić na drodze kochromatografii lub przy użyciu detektora diodowego, porównując spektra ekstraktu próbki z kalibracyjnym roztworem wzorca (3.6.2), zawierającym 6 µg/ml halofuginonu.

7.1.1. Kochromatografia

Ekstrakt próbki wzbogacamy dodatkiem odpowiedniej ilość pośredniego roztworu wzorcowego (3.6.2). Ilość dodanego halofuginonu powinna być porównywalna do ilości halofuginonu w ekstrakcie próbki. Może wzrosnąć wyłącznie wysokość piku halofuginonu odpowiednio do dodanej ilości i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie wysokości nie powinna przekraczać około 10% pierwotnej szerokości.

7.1.2. Użycie detektora diodowego

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

(a)  Długość fali odpowiadająca na spektrum maksymalnej absorbancji próbki i wzorca dla wierzchołka piku zarejestrowanego na chromatogramie musi być taka sama, po uwzględnieniu marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcyjnego. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm.

(b)  Zarejestrowane na chromatogramie wierzchołki pików próby badanej i wzorca w zakresie spektrum pomiędzy 220 i 350 nm nie mogą się różnić w przedziale absorbancji od 10 do 100%. Kryterium to stosujemy w przypadku obecności takich samych maksimów, a odchylenia między tymi dwoma widmami nie przekraczają 15% absorbancji wzorca analitycznego.

(c)  W zakresie od 220 do 350 nm odcinki wzrostu, maksimum i spadku na spektrum, dla piku próbki i wzorca nie powinny się różnić w przedziale od 10 do 100% absorbancji względnej. Kryterium to stosujemy, jeśli na spektrum obecne są te same piki, a różnice między spektrami dla wszystkich obserwowanych punktów nie przekraczają 15% absorbancji wierzchołka. Jeśli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, nie można uznać analizy za poprawną.

7.2. Powtarzalność

Dopuszczalna różnica między dwoma powtórzeniami oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać 0,5 mg/kg dla halofuginonu do 3 mg/kg.

7.3. Odzysk

Odzysk ze ślepej próby z dodatkiem wzorca nie może być mniejszy niż 80%.

7.5. OZNACZANIE DINITOLMIDU (DOT)

(3,5-dinitro-2-metylobenzoamid)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości DOT w paszach, koncentratach i premiksach przy zawartości składnika nie mniejszej niż 40 mg/kg. Pochodne furanowe interferują z DOT. Granica oznaczalności metody wynosi 40 mg/kg.

2. ZASADA METODY

DOT ekstrahuje się z próby rozcieńczonym acetonitrylem, następnie ekstrakt oczyszcza się za pomocą tlenku glinowego. Po przesączeniu roztwór odparowuje się do sucha, pozostałość rozpuszcza w N,N-dimetyloformamidzie i dodaje roztworu etylenodiaminy. Absorbancję otrzymanego w ten sposób barwnego roztworu mierzy się za pomocą spektrofotometru, przy 560 nm. Na podstawie zmierzonej absorbancji oblicza się zawartość DOT.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1 Acetonitryl, 85% roztwór (V/V):

Zmieszać 850 ml acetonitrylu i 150 ml wody (3.6). Mieszaninę poddać destylacji i zebrać frakcję wrzącą między 75 a 77°C.

3.2. Tlenek glinu do chromatografii kolumnowej:

Wyprażyć przez 2 godziny w temperaturze 750°C, ostudzić w eksykatorze. Przechowywać w brązowej butelce ze szklanym korkiem. Przed użyciem postępować w następujący sposób: 10 g tlenku umieścić w brązowej butelce i dodać 0,7 ml wody, zakorkować, ogrzewać przez 5 minut na wrzącej łaźni wodnej, wstrząsając energicznie. Ostudzić, ciągle wstrząsając butelkę. Sprawdzić przydatność do analizy, rozpoczynając proces od (5.1) i oznaczając zawartość DOT w podstawowym roztworze wzorcowym. Stopień odzysku DOT musi wynosić 100% ± 2% .

3.3. 95% (V/V) N,N-dimetyloformamid: wymieszać 95 ml N,N-dimetyloformamidu z 5 ml wody.

3.4. Etylenodiamina cz.d.a., o maksymalnej zawartości wody do 2%

3.5. Substancja wzorcowa

Czysty 3,5-dinitro-2-metylobenzoamid spełniający poniższą charakterystykę:

-   punkt topnienia: 177°C,

-   współczynnik absorbancji molowej przy 248 nm w acetonitrylu: 13,1 x 10³,

-   współczynnik absorbancji molowej przy 266 nm w N,N-dimetyloformamidzie: 10,1 x 10³.

3.6. Wzorcowy roztwór podstawowy: W kolbie miarowej o pojemności 200 ml umieścić 40 g substancji wzorcowej odważonej z dokładnością do 0,1 mg (3.5). Rozpuścić w acetonitrylu (3.1). Uzupełnić kolbę do kreski tym samym rozpuszczalnikiem i wymieszać. Następnie 20 ml roztworu rozcieńczyć acetonitrylem (3.1) w 100 ml w kolbie miarowej. l ml tego roztworu zawiera 40 µg DOT.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolba stożkowa o pojemności 250 ml ze szklanym korkiem

4.2. Chłodnica zwrotna ze szlifem

4.3. Tygiel porcelanowy ze spiekiem o porowatości G3, średnicy 60 mm

4.4. Filtr próżniowy (jak w aparacie Witta)

4.5. Łaźnia wodna ustawiona na temperaturę 50°C

4.6. Spektrofotometr z kuwetą o 10 mm drodze światła

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja i oczyszczanie

Odważyć 10 g rozdrobnionej, homogennej próbki z dokładnością do 1 mg. W przypadku koncentratów i premiksów odważyć około 1 g z dokładnością do 1 mg. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml (4.1) i dodać 65 ml acetonitrylu (3.1). Wymieszać, kolbę umieścić pod chłodnicą zwrotną (4.2) i ogrzewać na łaźni wodnej przez 30 minut, ciągle mieszając. Oziębić w strumieniu zimnej wody. Dodać 20 g tlenku glinu (3.2), wstrząsać przez 3 minuty i pozostawić do odstania. Do kolby o pojemności 100 ml przymocować filtr próżniowy (4.4) oraz tygiel porcelanowy (4.3), przesączyć roztwór (pod próżnią). Następnie pozostały osad na sączku przemyć kilkoma ml acetonitrylu (3.1) i odsączyć do sucha. Powtarzać tę czynność aż do uzyskania 95 ml przesączu. Uzupełnić kolbę do kreski acetonitrylem (3.1) i wymieszać. Jeśli zajdzie konieczność, rozcieńczyć przesącz acetonitrylem (3.1) tak, aby otrzymać roztwór o stężeniu od 5 do 15 µg/ml.

5.2. Wywołanie reakcji barwnej i pomiar absorbancji

Do trzech zlewek o pojemności 50 ml: A, B, i C odpipetować odpowiednio po 4 ml uprzednio otrzymanego roztworu. Dodatkowo do zlewki C (3.6) dodać 1 ml wzorcowego roztworu podstawowego. Umieścić zlewki na łaźni wodnej (4.5) pod digestorium i odparowywać w strumieniu powietrza. Zlewki ochłodzić do temperatury pokojowej. Dodać 10 ml N,N-dimetyloformamidu (3.3) do zlewki A, 2 ml do zlewki B i C, a następnie pozostawić na kilka minut, ciągle mieszając do całkowitego rozpuszczenia pozostałości. Następnie do zlewek B i C dodać po 8 ml etylenodiaminy (3.4), wymieszać. Po 5 minutach od dodania etylenodiaminy zmierzyć optyczną gęstość trzech roztworów na spektrofotometrze (4.6) przy 560 nm, stosując N,N-dimetyloformamid (3.3) jako roztwór odniesienia.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość DOT, w mg/kg, obliczyć według następującego wzoru:

(E_B - E_A)/(E_C - E_B) x F/w * 1.000,

w którym:

E_A -  absorbancja roztworu A (próba ślepa),

E_B -  absorbancja roztworu B (próba badana),

E_C -  absorbancja roztworu C (próba z wzorcem wewnętrznym),

w -   odważka, w g,

F -   współczynnik rozcieńczenia uzyskany w (5.1).

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Dopuszczalna różnica między powtórzeniami nie powinna przekraczać:

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej przy zawartości składnika poniżej 100 mg/kg;

-   10% wartości błędu względnego przy zawartości składnika 100 - 5.000 mg/kg;

-   500 ppm wartości bezwzględnej przy zawartości składnika 5.000 - 10.000 mg/kg;

-   5% wartości błędu względnego przy zawartości składnika powyżej 10.000 mg/kg.

7.6. OZNACZANIE ROBENIDYNY

(chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości robenidyny w paszach. Dolna granica wykrywalności metody wynosi 5 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbkę poddaje się ekstrakcji zakwaszonym metanolem. Ekstrakt oczyszcza się na kolumnie chromatograficznej wypełnionej tlenkiem glinu. Robenidynę z kolumny eluuje się metanolem, eluat zatęża i rozpuszcza w fazie ruchomej. Robenidynę oznacza się metodą chromatografii cieczowej wysokosprawnej z odwróconą fazą (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Metanol

3.2. Zakwaszony metanol

W kolbie miarowej o pojemności 500 ml umieścić 4 ml kwasu chlorowodorowego (P_20°C - 1,18 g/ml), uzupełnić zawartość do kreski metanolem (3.1) i wymieszać. Roztwór przygotować tuż przed użyciem.

3.3. Acetonityl o czystości do HPLC

3.4. Sito molekularne

Typ 3A, uziarnienie 8-12 mesh (ziarna wielkości 1,6 - 2,5 mm, krystaliczny glinokrzemian, średnica porównawcza 0,3 mm)

3.5. Tlenek glinu. Pierwszego stopnia aktywności kwasowej do chromatografii:

100 g tlenku glinu umieścić w naczyniu i dodać 2 ml wody. Naczynie zakorkować i wstrząsać przez około 20 minut. Przechowywać w dobrze zamkniętym naczyniu.

3.6. Roztwór diwodorofosforanu(V) potasu, c = 0,25 mol/l: 3,40 g diwodorofosforanu(V) potasu rozpuścić w 1000 ml wody w kolbie miarowej, wymieszać.

3.7. Monowodorofosforan(V) disodu, c = 0,025 mol/l: 3,55 g bezwodnego monowodorofosforanu(V) disodu (lub 4,45 g dihydratu, lub 8,95 g dekahydratu) rozpuścić w wodzie (o czystości do HPLC) w kolbie miarowej o pojemności 1.000 ml. Dopełnić kolbę do kreski i wymieszać.

3.8. Faza ruchoma do HPLC

Zmieszać razem:

650 ml acetonitrylu (3.3),

250 ml wody czystej do HPLC,

50 ml roztworu diwodorofosforanu(V) sodu (3.6)

50 ml roztworu monowodorofosforanu(V) disodu (3.7).

Przesączyć przez sączek o porach wielkości 0,22 µm i roztwór odgazować (np. traktując go przez 10 minut ultradźwiękami).

3.9. Substancja wzorcowa

Czysta robenidyna: chlorowodorek 1,3-bis[(4-chlorobenzylideno)amino]guanidyny, E 750

3.9.1. Podstawowy roztwór wzorcowy: 300 µg/ml

Odważyć 30 mg substancji wzorcowej (3.9) robenidyny z dokładnością do 0,1 mg. Rozpuścić w zakwaszonym metanolu (3.2) w 100 ml kolbie miarowej, uzupełnić kolbę do kreski i wymieszać. Kolbę owinąć folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

3.9.2. Pośredni roztwór wzorcowy robenidyny: 12 µg/ml

10 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.9.1) przenieść do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Po uzupełnieniu kolby do kreski fazą ruchomą wymieszać (3.8). Owinąć kolbę folią aluminiową i przechowywać w ciemnym miejscu.

3.9.3. Roztwory wzorcowe kalibracyjne

Do kolb miarowych o pojemności 50 ml odpipetować kolejno 5, 10, 15, 20 i 25 ml pośredniego roztworu standardowego (3.9.2). Dopełnić kolbę do kreski fazą ruchomą (3.8) i wymieszać. Roztworom tym odpowiada kolejno 1,2; 2,4; 3,6; 4,8; 6,0 µg/ml robenidyny. Roztwory przygotować bezpośrednio przed użyciem.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolumna szklana

Przygotować kolumnę ze szkła oranżowego wyposażoną w kran i zbiorniczek o pojemności około 150 ml. Średnica wewnętrzna od 10 do 15 mm i długość 250 mm.

4.2. Wstrząsarka laboratoryjna

4.3. Obrotowy odparowywacz próżniowy

4.4. Wyposażenie do HPLC z detektorem UV lub diodowym pracującym w zakresie 250 do 400 mm

4.4.1. Kolumna do chromatografii: 300 mm x 4 mm, C₁₈, wypełnienie 10 µm lub podobne

4.5. Sączek z włóknem szklanym Whatman GF/A lub podobny

4.6. Filtry membranowe, 0,22 µm

4.7. Filtry membranowe, 0,45 µm

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Robenidyna jest czuła na światło. Do wszystkich czynności należy używać szkła oranżowego.

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próbka paszy nie może zawierać ani robenidyny, ani innych substancji interferujących.

5.1.2. Należy przeprowadzić badanie odzysku, analizując ślepą próbkę paszy (5.1.1) z dodatkiem znanej ilości robenidyny, podobnej do występującej w badanej próbce. Wzbogacenie na poziomie 60 mg/kg robenidyny uzyskuje się, odparowując 30 ml podstawowego roztworu wzorcowego w strumieniu azotu (9.1) umieszczonego w kolbie miarowej do 0,5 ml, dodając 15 g ślepej próbki paszy. Po wymieszaniu i odczekaniu 10 minut rozpocząć ekstrakcję według (5.2).

Ślepa próbka paszy powinna być tego samego typu jak próbka badana. Analiza ślepej próbki paszy powinna potwierdzić niewystępowanie robenidyny.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 15 g wcześniej przygotowanej próbki. Odważkę umieścić w 250 ml kolbie stożkowej i dodać 100 ml zakwaszonego metanolu (3.2), zakorkować i wstrząsać przez godzinę na wstrząsarce (4.2). Przesączyć przez filtr szklany (4.5) i przesącz zebrać do 150 ml kolby stożkowej. Dodać 7,5 g sita molekularnego (3.4), zamknąć i wstrząsać przez 5 minut. Natychmiast przesączyć przez sączek z włóknem szklanym. Roztwór poddać procesowi oczyszczania (5.3).

5.3. Oczyszczanie

5.3.1. Przygotowanie kolumny z tlenkiem glinu. Kolumnę (4.1) zatkać od dołu korkiem z waty szklanej. Odważyć 11 g wcześniej przygotowanego tlenku glinu (3.5) i przenieść go do kolumny. Maksymalnie skrócić czas kontaktu tlenku glinu z atmosferą. Ubić zawartość, delikatnie stukając dolnym końcem o blat stołu, i pozostawić do ustabilizowania się układu.

5.3.2. Oczyszczanie próbki

Odpipetować 5 ml ekstraktu próbki otrzymanego w (5.2) i nanieść na kolumnę po ściance aż do zaabsorbowania przez tlenek glinu. Eluować robenidynę z kolumny 100 ml metanolu (3.1) przy przepływie od 2 do 3 ml/min, zbierając eluat do kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml. Na obrotowym odparowywaczu próżniowym odparować zawartość do sucha, pod próżnią w temperaturze 40°C. Pozostałość ponownie rozpuścić w 3 do 4 ml fazy ruchomej (3.8) i przenieść ilościowo do 10 ml kolby miarowej. Kolbę przemyć kilkakrotnie 1 do 2 ml porcjami fazy ruchomej i roztwór z przemycia wlać do kolby miarowej. Uzupełnić kolbę do kreski tym samym rozpuszczalnikiem i wymieszać. Ciecz przesączyć przez sączek o porach 0,45 µm (4.7). Roztworu następnie użyć do oznaczeń HPLC (5.4).

5.4. Oznaczanie przez HPLC

5.4.1. Parametry

Poniższe warunki podano dla przykładu. Można zastosować inne parametry, jeśli przy ich zastosowaniu uzyskuje się równoważne wyniki.

Kolumna do chromatografii cieczowej (4.4.1)

Faza ruchoma do HPLC (3.8)

Szybkość przepływu: 1,5 do 2 ml/min

Detektor o długości fali pomiarowej: 317 nm

Objętość dozowania: 20 do 50 µl

Sprawdzić stabilność układu chromatograficznego, dozując kilka razy roztwór kalibracyjny o stężeniu 3,6 µg/ml (3.9.3), aż do ustalenia się wysokości pików i czasów retencji.

5.4.2. Krzywa kalibracyjna

Dozować każdy z wzorcowych roztworów kalibracyjnych (3.7.3) kilka razy i zmierzyć wysokości (powierzchnie) pików dla każdego stężenia. Sporządzić krzywą zależności średnich wysokości lub powierzchni pików od odpowiednich stężeń w µg/ml wzorcowych roztworów kalibracyjnych. Sporządzić krzywą kalibracyjną. Na osi odciętych umieścić stężenia roztworów wzorcowych w µg/ml, a na osi rzędnych odpowiadające im średnie wysokości lub powierzchnie pików.

5.4.3. Badany roztwór próbki

Dozować kilkakrotnie taką samą objętość ekstraktu próbki (5.3.2) jak przy roztworach kalibracyjnych i wyznaczyć średnią wysokość lub powierzchnię piku robenidyny.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Stężenie robenidyny (µg/ml) w roztworze próbki badanej odczytujemy z wykresu (5.4.2), przyporządkowując zmierzonej wysokości piku odpowiednie stężenie. Zawartość robenidyny (w mg/kg) w próbce obliczyć według następującego wzoru:

w = c/m x 200,

w którym:

c -  stężenie robenidyny w roztworze próbki, wyrażone w µg/ml, odczytane z wykresu,

m -  masa badanej próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Sprawdzanie tożsamości

Tożsamość przeprowadzonej zanalizowanej substancji można potwierdzić na drodze kochromatografii lub przy użyciu detektora diodowego, porównując spektra ekstraktu próbki z roztworem kalibracyjnym zawierającym 6 µg/ml robenidyny.

7.1.1. Kochromatografia

Ekstrakt próbki wzbogacamy dodatkiem odpowiedniej ilość roztworu kalibracyjnego (3.9.3). Ilość dodanej robenidyny powinna być porównywalna do ilości robenidyny w ekstrakcie próbki. Może wzrosnąć tylko wysokość piku robenidyny odpowiednio do dodanej ilości i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie wysokości nie powinna przekraczać około 10% pierwotnej szerokości.

7.1.2. Użycie detektora diodowego

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

(a)  Długość fali odpowiadająca na spektrum maksymalnej absorbancji próbki i wzorca dla wierzchołka piku zarejestrowanego na chromatogramie musi być taka sama, po uwzględnieniu marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcyjnego. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm.

(b)  Pomiędzy 220 i 350 nm spektra próbki i wzorca, rejestrowane w szczytowym punkcie piku chromatografu, nie powinny się różnić więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują takie same maksima i gdy odchylenia między tymi dwoma widmami we wszystkich obserwowanych punktach nie przekraczają 15% absorbancji wzorcowego analitu.

(c)  Pomiędzy 220 a 350 nm spektra narastającego zbocza, wierzchołka i obniżającego się zbocza pików uzyskiwanych z ekstraktów próbek nie powinny się różnić od siebie więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują te same maksima i gdy wszystkie obserwowane punkty odchyleń pomiędzy spektrami nie przekraczają 15% absorbancji najwyższego piku widma.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie została potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Dopuszczalna różnica między dwoma powtórzeniami oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać 10% wartości błędu względnego mierzonego w stosunku do wyższego wyniku oraz przy zawartości robenidyny wyższej od 15 mg/kg.

7.3. Odzysk

Odzysk z ślepej próby z dodatkiem standardu nie może być mniejszy niż 90%.

7.7. OZNACZANIE AMPROLIUM

(chlorowodorek chlorku 1 -[(4-amino-2-propylopirymidyno-5-yl)metyl]-2-metylo-pirydyny)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania amprolium w paszach, koncentratach i premiksach o zawartości tego składnika powyżej 40 ppm.

2. ZASADA METODY

Polega na ekstrakcji amprolium rozcieńczonym metanolem, oczyszczeniu ekstraktu na kolumnie z tlenkiem glinu, wywołaniu reakcji barwnej przy użyciu metanolowego roztworu 2,7-dihydroksynaftalenu, heksacyjanożelazianu(III) potasu, roztworu cyjanku potasu i roztworu wodorotlenku sodu. Amprolium oznacza się spektrofotometrycznie przy 530 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Metanol

3.2. Rozcieńczony metanol: zmieszać 2 objętości metanolu (3.1) z jedną objętością wody.

3.3. Heksacyjanożelazian(III) potasu K₃Fe(CN)₆ 0,2% roztwór (m/v)

Roztwór jest stabilny przez 2 tygodnie.

3.4. 1% roztwór (w/v) cyjanku potasu. Roztwór nadaje się do użycia przez 2 tygodnie.

3.5. 1,125% roztwór (w/v) wodorotlenku sodu

3.6. Metanolowy roztwór wodorotlenku sodu: rozcieńczyć 15 ml roztworu (3.5) metanolem (3.1) do 200 ml.

3.7. 0,0025% roztwór (w/v) 2,7-dihydroksynaftalenu: rozpuścić 25 mg 2,7-dihydroksynaftalenu w metanolu (3.1) i uzupełnić metanolem (3.1) do kreski w kolbie o pojemności 1.000 ml.

3.8. Odczynnik do wywołania barwy: w kolbie stożkowej (4.1) o pojemności 250 ml umieścić 90 ml roztworu 2,7-dihydroksynaftalenu, dodać 5 ml heksacyjanożelazianu(III) potasu (3.3) i dobrze wymieszać. Następnie dodać 5 ml roztworu cyjanku potasu (3.4), zamknąć kolbę i wymieszać. Pozostawić na 30 do 35 minut. W następnej kolejności dodać 100 ml metanolowego roztworu wodorotlenku sodu (3.6), wymieszać i przesączyć przez lejek ze spiekiem (4.3). Używać odczynnika w 75 minut po filtracji.

3.9. Tlenek glinu do chromatografii kolumnowej

100 g tlenku glinu zalać 500 ml wody na ok. 30 minut. Ciecz znad osadu zlać, a tlenek glinu trzykrotnie przemyć 50 ml porcjami metanolu (3.1), odsączyć pod próżnią. Osad pozostawić na powietrzu przez noc, a następnie suszyć przez 2 h w temperaturze 100°C w suszarce próżniowej. Umieścić w eksykatorze i ostudzić. Sprawdzić przydatność tlenku glinowego do analizy za pomocą roztworu standardowego (3.11), rozpoczynając proces od (5.2). Odzysk amprolium powinien wynosić 100% ± 4%.

3.10. Substancja wzorcowa: czyste amprolium spełniające poniższą charakterystykę

Punkt topnienia (rozkładu): 248°C

Współczynnik absorbancji molowej przy 265 i 235 nm w wodzie destylowanej: 11,0 x 10³

3.11. Roztwór wzorcowy: odważyć 50 mg z dokładnością do 0,1 mg substancji wzorcowej (3.10). Rozpuścić w rozcieńczonym metanolu (3.2) w kolbie miarowej o pojemności 500 ml, dopełnić do kreski i wymieszać. 10 ml roztworu rozcieńczyć metanolem (3.2) do objętości 50 ml w kolbie miarowej i dokładnie wymieszać. 1 ml roztworu zawiera 20 µg amprolium.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolby stożkowe o pojemności 50, 250, 500 ml, ze szklanymi korkami

4.2. Mieszadło

4.3. Lejek ze spiekiem porowatym G3 o średnicy 60 mm

4.4. Kolumna szklana do chromatografii (średnica wewnętrzna 9 mm, długość 400 do 500 mm)

4.5. Wirówka z probówkami wirówkowymi o pojemności 25 ml, ze szklanymi korkami

4.6. Spektrofotometr z kuwetami o 10 mm drodze światła

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja i oczyszczanie

5.1.1. Pasze i premiksy

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g homogennej próbki. W przypadku premiksów odważka powinna wynosić od 3 do 6 g. Umieścić ją w 250 ml kolbie stożkowej (4.1), dodać dokładnie 100 ml rozcieńczonego metanolu (3.2). Wstrząsać przez 60 minut i przesączyć. Jeśli zajdzie potrzebna, rozcieńczyć przesącz rozcieńczonym metanolem (3.2) tak, aby otrzymać stężenie amprolium 5 do 15 µg/ml. Kolumnę chromatograficzną zamknąć od dołu wacikiem bawełnianym (4.4), wsypać 5 g tlenku glinowego (3.9), a następnie zalać kolumnę 25 ml ekstraktu. Przepuścić ciecz przez kolumnę, odrzucić pierwsze 5 ml wycieku, a następne 12 ml zebrać do wykalibrowanej probówki.

5.1.2. Koncentraty (preparaty amprolium)

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 0,5 g homogennej próbki i umieścić ją w kolbie stożkowej o pojemności 5.000 ml (4.1).

Dodać 250 ml rozcieńczonego metanolu (3.2), wstrząsać lub mieszać przez 60 minut, przesączyć. 5 ml filtratu rozcieńczyć w kolbie miarowej rozcieńczonym metanolem (3.2) do objętości 200 ml.

5.2. Wywołanie reakcji barwnej i pomiar absorbancji

5 ml roztworu otrzymanego w (5.1.1) umieścić w probówce wirówkowej oznaczonej symbolem A (4.5). 5 ml rozcieńczonego metanolu (3.2) przenieść do probówki wirówkowej B (4.5). Do każdej probówki dodać po 10 ml barwnego odczynnika (3.8), zakorkować, wymieszać i pozostawić na 18 minut. Następnie wirować przez 3 minuty i zdekantować roztwory A i B do kolb stożkowych o pojemności 50 ml (4.1). Niezwłocznie wykonać spektrofotometryczny pomiar absorbancji roztworu A przy 530 nm, używając roztworu B jako roztworu odniesienia. Zawartość amprolium wyznaczyć z krzywej kalibracyjnej (5.3).

5.3. Krzywa kalibracyjna

Za pomocą pipety przenieść do pięciu probówek wirówkowych kolejno 1, 2, 3, 4 i 5 ml roztworu wzorcowego (3.11). Do pierwszych czterech probówek dodać odpowiednią ilość rozcieńczonego metanolu (3.2) tak, aby wszędzie znajdowało się po 5 ml cieczy. Do wszystkich pięciu probówek dodać po 10 ml odczynnika wywołującego barwę (3.8). Po zakorkowaniu wymieszać zawartość w probówkach i pozostawić na 18 minut. Po tym czasie wirować przez 3 minuty i zdekantować roztwór do 50 ml kolby stożkowej (4.1). Niezwłocznie dokonać pomiaru absorbancji na spektrofotometrze przy 530 nm, używając 5 ml rozcieńczonego metanolu (3.2) z dodatkiem 10 ml odczynnika wywołującego barwę (3.8) jako roztworu odniesienia. Sporządzić krzywą kalibracyjną, odkładając na osi rzędnych absorbancję, a na osi odciętych odpowiednio ilości amprolium, w mg.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

6.1. Pasze i premiksy

Zawartość amprolium, w mg/kg, obliczamy według następującego wzoru:

A/W x F x 20000

6.2. Koncentraty (preparaty amprolium)

A/W x 200

A -   ilość amprolium, w mg, oznaczona fotometrycznie,

W -   odważka, w g,

F -   współczynnik rozcieńczenia.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Dopuszczalne różnice między powtórzeniami nie mogą przekroczyć poniższych wartości:

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej przy zawartości składnika poniżej 100 mg/kg,

-   10% wartości względniej przy zawartości składnika od 100 do 5.000 mg/kg,

-   500 mg/kg wartości bezwzględnej przy zawartości od 5.000 do 10.000 mg/kg,

-   5% wartości względniej przy zawartości składnika powyżej 10.000 mg/kg.

7.8. OZNACZANIE BUCHINOLANU

(etylo-4-hydroksy-6,7-diizobutoksy-3-chinolino-karboksylan)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości buchinolanu w mieszankach paszowych, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 10 mg/kg. Dekachinat interferuje przy oznaczaniu.

2. ZASADA METODY

Ekstrakcja próbki chloroformem. Odparowanie ekstraktu do sucha, rozpuszczenie ekstraktu w chloroformie i poddanie chromatografii cienkowarstwowej. Buchinolan jest eluowany etanolem i oznaczany spektrofluorymetrycznie przez porównanie z roztworami wzorcowymi.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Chloroform

3.2. Etanol 96% (V/V)

3.3. Mieszanina chloroformu i etanolu: zmieszać 10 objętości chloroformu (3.1) z jedną objętością etanolu (3.2)

3.4. Etanol, roztwór 80% (V/V)

3.5. Żel krzemionkowy G do chromatografii cienkowarstwowej

3.6. Substancja wzorcowa: czysty buchinolan

3.7. Roztwory wzorcowe

3.7.1. Roztwór wzorcowy o stężeniu 0,2 mg buchinolanu w 1 ml

Odważyć 50 mg, z dokładnością do 0,1 mg, substancji wzorcowej (3.6). Rozpuścić w chloroformie (3.1) w kolbie miarowej o pojemności 250 ml, ogrzewając w łaźni wodnej przy temperaturze 50°C. Schłodzić do temperatury pokojowej, dopełnić do kreski chloroformem (3.1) i zamieszać.

3.7.2. Roztwory wzorcowe robocze: przenieść 5, 10, 15, 20 i 25 ml roztworu (3.7.1) do kolb miarowych o pojemności 25 ml. Dopełnić do kreski chloroformem (3.1) i zamieszać. Przygotować tuż przed użyciem. Roztwory zawierają odpowiednio 0,04; 0,08; 0,12; 0,16 i 0,20 mg buchinolanu w 1 ml.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolby stożkowe z korkami ze szlifem, o pojemności 50 ml i 250 ml

4.2. Wstrząsarka

4.3. Wirówka z probówkami o pojemności 15 ml, zaopatrzonymi w korki ze szlifem

4.4. Łaźnia wodna ustawiona na temperaturę 50°C

4.5. Wyposażenie do chromatografii cienkowarstwowej

4.6. Płytki szklane do chromatografii cienkowarstwowej, 200 x 200 mm, przygotowane w następujący sposób. Nałożyć na płytki jednolitą warstwę żelu krzemionkowego G grubości 0,5 mm i pozostawić na powietrzu przez 15 minut celem wysuszenia. Suszyć płytki w suszarce (4.11) przez dwie godziny i umieścić w eksykatorze zawierającym odwodniony żel krzemionkowy. Płytki nadają się do użycia, jeżeli pozwalają na uzyskanie wyników podobnych do tych otrzymanych przy zastosowaniu płytek przygotowanych wcześniej.

4.7. Mikropipety 0,50 ml

4.8. Komora do chromatografii cienkowarstwowej

4.9. Lampa ultrafioletowa o krótkim zakresie fal

4.10. Spektrofluorymetr wyposażony w lampę ksenonową i dwa monochromatory

4.11. Suszarka wyposażona w wentylator, nastawiona na temperaturę 100°C

4.12. Próżniowy odparowywacz obrotowy, wyposażony w kolbę o pojemności 250 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby w całości przesiewała się przez sito o boku oczka kwadratowego 1 mm.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, homogenną próbkę zawierającą około 1,25 mg buchinolanu. Umieścić odważkę w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml (4.1) i dodać 100 ml chloroformu (3.1). Wymieszać, zamknąć kolbę, i wstrząsać przez 1 godzinę na wstrząsarce (4.2). Zdekantować, przesączyć i odrzucić pierwsze mililitry przesączu. Przenieść 80 ml klarownego filtratu do zlewki o pojemności 150 ml lub do 250 ml kolby dołączanej do odparowywacza próżniowego (4.12). Odparować prawie do sucha na łaźni wodnej (4.4), rozpuścić oleistą pozostałość w kilku mililitrach chloroformu (3.1) i przenieść ilościowo ciecz do kolby miarowej o pojemności 10 ml, stosując rozdzielacz z cienką końcówką. Dopełnić do kreski chloroformem (3.1) i zamieszać. Jeżeli roztwór nie jest klarowny, odwirować przez 3 minuty przy 3.000 obr/min, stosując zamykane probówki.

5.3. Chromatografia cienkowarstwowa

Przy użyciu mikropipety (4.7) nanieść na płytki do chromatografii cienkowarstwowej (4.6), w odstępach co 2 cm, objętości równe 0,25 ml ekstraktu otrzymanego według (5.2) i pięć roboczych roztworów wzorcowych (3.7.2).

Rozwijać chromatogram przy użyciu chloroformu (3.1) do czasu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze do górnej krawędzi płytki, następnie suszyć w strumieniu powietrza. Rozwijać w mieszaninie chloroform - etanol (3.3) do czasu, gdy czoło rozpuszczalnika przebędzie około 12 cm. Odparować rozpuszczalniki. Naświetlić chromatogram światłem ultrafioletowym (4.9) i, używając igły, zaznaczyć granice plamek buchinolanu (wartość Rf 0,4 do 0,6).

5.4. Elucja

Zebrać żel krzemionkowy z każdej zaznaczonej plamki, stosując kolektor stref (4.8) i umieścić w probówkach wirówkowych. Dodać do każdej probówki po 10 ml etanolu (3.4), wstrząsać przez 20 minut i odwirować przez 5 minut przy 3.000 obr/min. Zdekantować oczyszczony przesącz do kolby stożkowej o pojemności 50 ml.

5.5. Pomiar fluorescencji

Ustawić skalę spektrofluorymetru (4.10) na 100 za pomocą eluatu uzyskanego z roztworu wzorcowego o najwyższym stężeniu, naświetlając roztwór promieniowaniem o długości fali od 200 do 280 nm dającym najbardziej intensywną fluorescencję i przy długości fali emisji 375 nm. W tych warunkach zmierzyć fluorescencję pozostałych eluatów (5.4). Na podstawie uzyskanych wartości określić w mg ilość (A) buchinolanu w 10 ml eluatu z próbki.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość buchinolanu, w mg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

A

--- x 50.000,

B

w którym:

A -   ilość, w mg, buchinolanu określona za pomocą pomiaru spektrofluorymetrycznego,

B -   odważka próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać:

-   50% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości buchinolanu pomiędzy 10 a 20 mg/kg;

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 20 do 100 mg/kg;

-   10% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości od 100 do 5.000 mg/kg;

-   500 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 5.000 do 10.000 mg/kg;

-   5% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości powyżej 10.000 mg/kg.

7.9. OZNACZANIE SULFOCHINOKSALINY

((2-4-aminobenzenosulfonamido)chinoksalina)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości sulfochinoksaliny w mieszankach paszowych, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 20 mg/kg. Inne sulfonamidy i kwas arsanilowy interferują przy oznaczaniu.

2. ZASADA METODY

Ekstrakcja próbki dimetyloformamidem i chloroformem. Hydroliza sulfochinoksaliny w alkalicznym środowisku. Po zobojętnieniu utworzenie diazoniowych pochodnych aminowych i połączenie z N-2-aminoetylo-1-naftyloaminą. Pomiar absorbancji roztworu przy 545 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. N,N-dimetyloformamid

3.2. Chloroform

3.3. Alkohol etylowy absolutny

3.4. Alkaliczna solanka: rozpuścić 10 g wodorotlenku sodu i 25 g chlorku sodu w wodzie. Dopełnić do objętości 500 ml wodą i zamieszać.

3.5. Kwas chlorowodorowy stężony, d = 1,18 g/ml

3.6. Azotyn sodu, roztwór 0,1% (m/V): rozpuścić 100 mg azotynu sodu w wodzie, dopełnić do 100 ml wodą i zamieszać. Przygotować tuż przed użyciem.

3.7. Sulfonian amonu, roztwór 0,5% (m/V): rozpuścić 500 mg sulfonianu amonu w wodzie, dopełnić do objętości 100 ml wodą i zamieszać. Przygotować tuż przed użyciem.

3.8. N-2-aminoetylo-1-naftyloaminy dichlorowodorek, roztwór 0,1% (m/V): rozpuścić 100 mg chlorowodorku N-2-aminoetylo-1-naftyloaminy w 0,1% (V/V) kwasie chlorowodorowym; dopełnić do 100 ml tym samym kwasem i zamieszać. Przygotować tuż przed użyciem.

3.9. Substancja wzorcowa: czysta sulfochinoksalina

3.10. Roztwór wzorcowy: odważyć 250 mg, z dokładnością do 0,1 mg, substancji wzorcowej (3.9). Rozpuścić w 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (25 ml 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu + 25 ml wody), dopełnić wodą do 500 ml i zamieszać. Pobrać 5 ml i rozcieńczyć do 100 ml wodą. 1 ml tego roztworu zawiera 25 µg sulfochinoksaliny.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolby stożkowe z korkami ze szlifem, o pojemności 250 ml

4.2. Wstrząsarka

4.3. Lejek ze spiekiem szklanym, porowatość nr 3, średnica 80 mm, z kolbą filtracyjną

4.4. Rozdzielacze o pojemności 250 ml

4.5. Kolby miarowe o pojemności 50, 100, 250 i 500 ml

4.6. Probówki 150 mm na 25 mm

4.7. Łaźnia parowa

4.8. Spektrofotometr wyposażony w 20 mm kuwety

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbek

Rozdrobnić próbkę tak, aby w całości przesiewała się przez sito o boku oczka kwadratowego 1 mm.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, homogenną próbkę zawierającą pomiędzy 0,25 a 1,25 mg sulfochinoksaliny. Umieścić odważkę w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml (4.1) i dodać 20 ml N,N-dimetyloformamidu (3.1). Wymieszać i ogrzewać kolbę na łaźni wodnej (4.7) przez 20 minut. Schłodzić w strumieniu zimnej wody. Dodać 60 ml chloroformu (3.2), zamknąć kolbę i wstrząsać przez 30 minut na wstrząsarce (4.2).

Przesączyć ciecz przez lejek ze spiekiem (4.3) przy niewielkim podciśnieniu. Spłukać kolbę filtracyjną czterema porcjami chloroformu (3.2) po 5 ml i przesączyć popłuczyny przez lejek ze spiekiem. Przenieść przesącz do rozdzielacza (4.4), spłukać kolbę filtracyjną przy użyciu 15 ml chloroformu (3.2) i przenieść popłuczyny do rozdzielacza.

5.3. Hydroliza

Dodać do rozdzielacza 50 ml alkalicznej solanki (3.4) i 5 ml etanolu (3.3). Dokładnie wymieszać, przez powolne odwracanie rozdzielacza około 20 razy lub obracając rozdzielacz w pozycji pionowej, nie dopuszczając do utworzenia emulsji. Pozostawić celem rozdzielenia warstw (rozdział warstw następuje zwykle po 15 minutach). Przenieść górną warstwę (faza wodna) do kolby miarowej o pojemności 250 ml (4.5). Ekstrahować warstwę chloroformową, stosując trzy następne 50 ml porcje solanki alkalicznej (3.4), dodając każdorazowo wodny ekstrakt do zawartości w kolbie miarowej o pojemności 250 ml. Dopełnić do kreski wodą i zamieszać. Przenieść 25 ml roztworu do kolby miarowej (4.5) o pojemności 50 ml, dodać 5 ml kwasu chlorowodorowego (3.5), dopełnić do kreski wodą i zamieszać. W razie potrzeby przesączyć, odrzucając pierwsze 15 ml przesączu. Przenieść 10 ml części roztworu do dwóch probówek (4.6) - A i B.

5.4. Wywołanie barwy i pomiar absorbancji

Do każdej probówki dodać 2 ml roztworu azotynu sodu (3.6), zamieszać i pozostawić na trzy minuty. Dodać 2 ml sulfonianu amonu (3.7), zamieszać i pozostawić na dwie minuty. Dodać 1 ml roztworu dichlorowodorku 2-aminoetylo-1-naftyloaminy (3.8) do probówki A i 1 ml wody do probówki B. Dokładnie wymieszać zawartość każdej probówki. Przy użyciu pompki wodnej wytworzyć niewielkie podciśnienie w każdej probówce, podłączonej do pompki poprzez korek z gumy, celem usunięcia azotu rozpuszczonego w roztworze.

Po 10 minutach zmierzyć absorbancję EA i EB roztworów w spektrofotometrze (4.8) przy długości fali 545 nm, stosując wodę jako próbę odniesienia. Z wartości EA - EB obliczyć ilość (A) sulfochinoksaliny zawartej w roztworze próbki przez porównanie do uprzednio przygotowanej krzywej kalibracyjnej (5.5).

5.5. Krzywa kalibracyjna

Przenieść kolejno do kolb miarowych o pojemności 100 ml (4.5) 2, 4, 6, 8 i 10 ml roztworu wzorcowego (3.10) odpowiadającego 50, 100, 150, 200 i 250 µg sulfochinoksaliny. Dodać 8 ml kwasu chlorowodorowego (3.5) do każdej kolby, dopełnić do kreski wodą i zamieszać. Odpipetować po 10 ml każdego roztworu (co odpowiada 5, 10, 15, 20 i 25 µg sulfochinoksaliny) do probówek (4.6). Przeprowadzić reakcję barwną, jak podano w (5.4). Zmierzyć absorbancję przy 545 nm wobec wody. Wykreślić krzywą wzorcową, odkładając wartości absorbancji na osi rzędnych i odpowiadające im, wyrażone w µg, ilości sulfochinoksaliny na osi odciętych.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość sulfochinoksaliny, w mg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

A

--- x 50,

B

w którym:

A -   ilość, w mg, sulfochinoksaliny określona za pomocą pomiaru fotometrycznego,

B -   odważka próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych z tej samej próbki nie może przekraczać:

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej sulfochinoksaliny dla zawartości od 20 do 100 mg/kg;

-   10% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości od 100 do 5.000 mg/kg;

-   500 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 5000 do 10.000 mg/kg;

-   5% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości powyżej 10.000 mg/kg.

7.10. OZNACZANIE FURAZOLIDONU

(3-(5-nitrofurfurylidenoamino)-oksazolidyno-2-on)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości furazolidonu w mieszankach paszowych, koncentratach i premiksach. Granica oznaczalności metody wynosi 10 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Furazolidon, po wstępnej ekstrakcji próbki eterem naftowym w celu usunięcia tłuszczu, ekstrahuje się acetonem. Ekstrakt jest oczyszczany metodą chromatografii kolumnowej na tlenku glinowym, furazolidon jest eluowany acetonem. Acetonowy eluat odparowywuje się do sucha, a pozostałość rozpuszcza w pentanolu. Furazolidon jest następnie ekstrahowany z pentanolu przy użyciu wodnego roztworu mocznika, absorbancję ekstraktu mierzy się przy 375 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Aceton

3.2. Tlenek glinu do chromatografii, obojętny, 100 do 240 mesh, przygotowany w następujący sposób: wstrząsać 500 g tlenku glinu z 1l gorącej destylowanej wody i zdekantować ciecz znad tlenku. Powtórzyć to postępowanie dwukrotnie i przesączyć, używając lejka Buchnera. Wysuszyć tlenek glinu przy temperaturze 105°C stałej masy.

3.3. Octan pentylu

3.4. Pentanol (może być stosowana substancja zawierająca mieszaninę izomerów)

3.5. Eter naftowy, zakres temperatury wrzenia od 40 do 60°C

3.6. Mocznik, roztwór. Rozpuścić 90 g mocznika w 100 ml wody, ostrożnie podgrzać w celu całkowitego rozpuszczenia.

3.7. Substancja wzorcowa: czysty furazolidon

3.8. Roztwór wzorcowy: Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg substancji wzorcowej (3.7), rozpuścić w acetonie (3.1) w kolbie miarowej o pojemności 250 ml (4.1), dopełnić do kreski acetonem (3.1) i zamieszać, 1 ml tego roztworu zawiera 100 µg furazolidonu.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolby miarowe o pojemności 100 i 250 ml ze szkła oranżowego

4.2. Rozdzielacze o pojemności 100 ml ze szkła oranżowego

4.3. Aparatura do ekstrakcji, np. Soxhleta lub Twisselmanna

4.4. Gilzy ekstrakcyjne, 25 x 80 mm lub 28 x 100 mm

4.5. Kolumny do chromatografii, średnica wewnętrzna: 10 mm, długość 300 mm

4.6. Łaźnia parowa

4.7. Spektrofotometr wyposażony w 10 mm kuwety

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Wszystkie czynności należy wykonywać w przyciemnionym świetle.

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby w całości przesiewała się przez sito o boku oczka kwadratowego 1 mm.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością do 1 mg, od 5 do 20 g ostatecznie rozdzielonej i rozdrobnionej próbki (zawierającej nie więcej niż l mg furazolidonu) do gilzy ekstrakcyjnej (4.4) i umieścić w aparacie do ekstrakcji (4.3). Ekstrahować eterem naftowym, (3.5) zapewniając, w przypadku aparatu Soxhleta, od 13 do 17 cykli przelewu rozpuszczalnika; w przypadku stosowania innych ekstraktorów pozostawić co najmniej 30 minut na tym etapie. Wyjąć gilzę z ekstraktora, odsączyć pozostałości rozpuszczalnika, wysuszyć gilzę i ekstrahowaną paszę w strumieniu gorącego powietrza.

Umieścić suchą gilzę z pozostałością w czystym aparacie ekstrakcyjnym i ekstrahować acetonem (3.1), zapewniając co najmniej 25 cykli przelewów rozpuszczalnika w przypadku stosowania aparatu Soxhleta. Dokładne warunki pozwalające na uzyskanie całkowitej ekstrakcji należy określić wstępnie dla każdego urządzenia. Odparować acetonowy ekstrakt do objętości od 5 do 10 ml na łaźni parowej (4.6) i schłodzić do temperatury pokojowej.

5.3. Chromatografia

Umieścić zwitek waty szklanej w dolnej części kolumny chromatograficznej (4.5) i, za pomocą odpowiedniego pręta szklanego, upchnąć w postaci warstwy o grubości 2 do 3 mm. Przygotować zawiesinę tlenku glinu (3.2) w acetonie (3.1), umieścić w kolumnie i pozostawić celem opadnięcia zawiesiny. Wysokość słupa tlenku glinu w tak przygotowanej kolumnie powinna wynosić około 200 mm. Obniżyć poziom acetonu do górnej warstwy tlenku glinu. Przenieść acetonowy ekstrakt otrzymany według (5.2) z kolby na kolumnę, spłukać kolbę kilkakrotnie acetonem (3.1) i przenieść ciecz na kolumnę. Umieścić odpowiednią kolbę pod kolumną i eluować furazolidon acetonem (3.1). Całkowita objętość użytego acetonu, łącznie z popłuczynami, powinna wynosić około 150 ml.

5.4. Ekstrakcja i pomiar absorbancji

Odparować acetonowy eluat (5.3) do sucha na łaźni parowej (4.6). (Czasami mogą pozostawać niewielkie ilości alkoholu diacetonowego, powstającego w wyniku kondensacji acetonu na tlenku glinu, lecz nie wpływa to na dalszą ekstrakcję). Rozpuścić pozostałość w 10 ml pentanolu (3.4) i przenieść roztwór do rozdzielacza (4.2). Powtórzyć ostatnią czynność, używając 10 ml octanu pentylu (3.3). W końcu spłukać naczyńko, które zawierało pozostałości ekstraktu, stosując 10 ml roztworu mocznika (3.6), dodać do rozdzielacza i wstrząsać energicznie przez dwie minuty.

Pozostawić na trzy do czterech minut w celu rozdzielenia faz i przenieść wodny ekstrakt do kolby objętościowej o pojemności 100 ml (4.1). Powtórzyć płukanie i etap ekstrakcji czterokrotnie, stosując po 10 ml roztworu mocznika (3.6) i przenieść wodne ekstrakty do kolby miarowej. Rozcieńczyć zawartość kolby miarowej do 100 ml roztworem mocznika (3.6) i zamieszać. Zmierzyć absorbancję roztworu w spektrofotometrze (4.7) przy 375 nm, stosując jako odnośnik roztwór mocznika (3.6). Oznaczyć ilość furazolidonu, wykorzystując krzywą wzorcową (5.5).

5.5. Krzywa wzorcowa

Przygotować cztery kolumny chromatograficzne, jak opisano w (5.3). Odmierzyć do oddzielnych kolumn odpowiednio 2,5; 5; 5,5 i 10 ml roztworu wzorcowego (3.8). Przemyć każdą z czterech kolumn każdorazowo przy użyciu 150 ml acetonu (3.1) i kontynuować według (5.4). Wykreślić krzywą kalibracyjną, odkładając na osi rzędnych wartości absorbancji, a na osi odciętych odpowiadające im ilości furazolidonu w µg.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość furazolidonu, w mg/kg, obliczyć według wzoru:

A

--- x 50,

B

w którym:

A -   ilość furazolidonu, w µg, określona za pomocą pomiaru fotometrycznego,

B -   odważka próbki, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych z tej samej próbki nie może przekraczać:

-   50% wartości względnej w stosunku do wyższego wyniku dla zawartości furazolidonu od 10 do 20 mg/kg;

-   10 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 20 do 100 mg/kg;

-   10% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości od 100 do 5.000 mg/kg;

-   500 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 5000 do 10.000 mg/kg;

-   5% w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości powyżej 10.000 mg/kg.

7.11. OZNACZANIE AMPROLIUM METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

(chlorowodorek chlorku 1-[(4-amino-2-propylopirymidyno-5-yl)metyl]-2-metylo-pirydyny)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania amprolium w paszach i mieszankach wstępnych. Granica wykrywalności wynosi 1 mg/kg, granica oznaczalności wynosi 25 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowana wodnym roztworem metanolu. Po rozcieńczeniu fazą ruchomą i przesączeniu przez sączek membranowy zawartość amprolium jest oznaczana metodą jonowymiennej wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC przy wykorzystaniu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Metanol

3.2. Acetonitryl, czysty do HPLC

3.3. Woda, do HPLC

3.4. Diwodorofosforan(V) sodu, roztwór c = 0,1 mol/l

Rozpuścić 13,80 g monohydratu diwodorofosforanu(V) sodu w wodzie (3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1.000 ml, uzupełnić wodą (3.3) do kreski i wymieszać.

3.5. Roztwór nadchloranu sodu, c = 1,6 mol/l

Rozpuścić 224,74 g monohydratu nadchloranu sodu w wodzie (3.3) w kolbie miarowej o pojemności 1.000 ml, uzupełnić wodą (3.3) do kreski i wymieszać.

3.6. Faza ruchoma do HPLC (8.1)

Mieszanina acetonitrylu (3.2), roztworu diwodorofosforanu(V) sodu (3.4) oraz roztworu nadchloranu sodu (3.5) 450 + 450 + 100 (v + v + v). Przed użyciem przesączyć przez sączek membranowy 0,22 µm (4.3) i odgazować roztwór (np. w łaźni ultradźwiękowej (4.4) przez co najmniej 15 minut).

3.7. Substancja wzorcowa: czyste amprolium, chlorowodorek chlorku 1-[(4-amino-2-propylopirymidyno-5-yl)metyl]-2-metylo-pirydyny, E 750 (8.2)

3.7.1. Roztwór wzorcowy podstawowy amprolium, 500 µg/ ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg amprolium (3.7) do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w 80 ml metanolu (3.1) i umieścić kolbę na 10 minut w łaźni ultradźwiękowej (4.4). Następnie doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić do znaku wodą i zamieszać. W temperaturze Ł 4°C roztwór zachowuje stabilność przez 1 miesiąc.

3.7.2. Pośredni podstawowy roztwór amprolium, 50 µg/ml

Przenieść pipetą 5 ml wzorcowego podstawowego roztworu (3.7.1 ) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do znaku roztworem do ekstrakcji (3.8) i wymieszać. W temperaturze Ł 4°C roztwór zachowuje stabilność przez 1 miesiąc.

3.7.3. Roztwory kalibracyjne

Przenieść 0,5, 1,0, i 2,0 ml pośredniego roztworu podstawowego (3.7.2) do kilku kolb miarowych o pojemności 50 ml. Uzupełnić do kreski fazą ruchomą (3.6) i zamieszać. Stężenia amprolium w roztworach wynoszą odpowiednio 0,5, 1,0 i 2,0 µg/ml. Roztwory należy sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.8. Roztwór do ekstrakcji

Mieszanina metanolu (3.1 ) i wody 2 + 1 (v + v)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Zestaw do HPLC z dozownikiem umożliwiającym dozowanie 100 µl cieczy

4.1.1. Kolumna do chromatografii cieczowej 125 mm x 4 mm, z żywicą jonowymienną kationową Nucleosil 10 SA, wypełnienie 10 µm lub równoważne

4.1.2. Detektor UV z regulacją długości fal lub detektor diodowy

4.2. Sączek membranowy, PTFE, 0,45 µm

4.3. Sączek membranowy, 0,22 µm

4.4. Łaźnia ultradźwiękowa

4.5. Wstrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Pasza bez substancji oznaczanej

Dla potrzeb badania odzysku należy przeprowadzić analizę próbki paszy bez amprolium w celu upewnienia się, że nie zawiera amprolium ani substancji zakłócających. Rodzaj paszy bez amprolium powinien być podobny do paszy występującej w analizowanej próbce, a analiza powinna potwierdzić brak amprolium i substancji zakłócających.

5.1.2. Badanie odzysku

Badanie odzysku należy przeprowadzić, poddając analizie próbkę paszy bez amprolium, do której dodano taką ilość amprolium, która jest podobna do występującej w próbce. W celu uzyskania zawartości na poziomie 100 mg/kg należy dodać 10,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.7.1) do 250 ml kolby stożkowej i odparować roztwór do około 0,5 ml. Dodać 50 g paszy bez amprolium, starannie wymieszać i pozostawić na 10 min, mieszając kilkakrotnie przed przejściem do etapu ekstrakcji (5.2).

Alternatywnie, jeżeli nie ma próbki paszy o typie zbliżonym do próbki badanej (5.1.1), badanie odzysku można przeprowadzić, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest uzupełniana pewną ilością amprolium podobną do już obecnej w próbce. Próbka ta jest poddawana analizie wraz z próbką bez zwiększonej zawartości amprolium i odzysk może być obliczony przez odejmowanie.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Premiksy (zawartość < 1% amprolium) i pasze

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, 5 do 40 g próbki w zależności od zawartości amprolium do kolby stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 200 ml roztworu do ekstrakcji (3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i umieścić na 1 godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (4.5). Rozcieńczyć część ekstraktu fazą ruchomą (3.6) do zawartości amprolium 0,5 do 2 µg/ml i wymieszać (8.3). Przesączyć 5 do 10 ml tego rozcieńczonego roztworu przez sączek membranowy (4.2). Przejść do oznaczania HPLC (5.3).

5.2.2. Premiksy (zawartość ł 1,0% amprolium)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, od 1 do 4 g premiksu w zależności od zawartości amprolium do 500 ml kolby stożkowej, dodać 200 ml roztworu do ekstrakcji (3.8). Umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej na 15 minut. Wyjąć kolbę z łaźni i umieścić na 1 godzinę na wstrząsarce lub mieszadle magnetycznym (4.5). Rozcieńczyć część ekstraktu fazą ruchomą (3.6) do zawartości amprolium od 0,5 do 2 µg/ml i wymieszać. Przesączyć 5 do 10 ml tego rozcieńczonego roztworu przez sączek membranowy (4.2). Przejść do oznaczania HPLC (5.3).

5.3. Oznaczanie HPLC

5.3.1. Parametry

Poniższe warunki są wskazane jako przykładowe; inne warunki mogą być zastosowane tylko w przypadku, gdy prowadzą do uzyskania takich samych wyników.

Kolumna do chromatografii cieczowej (4.1.1)

                                      125 mm x 4 mm, żywica jonowymienna

                                      Nucleosil 10 S.A., wypełnienie 10 µm

                                      lub podobne

Faza ruchoma (3.6):                   Mieszanina acetonitrylu (3.2), roztworu

                                      diwodorofosforanu(V) sodu (3.4) i roztworu

                                      nadchloranu sodu (3.5) 450 + 450 + 100

                                      (v + v + v)

Przepływ:                             0,7 - 1 ml/min

Długość fali detekcji:                264 nm

Dozowana objętość:                    100 µl

Sprawdzić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór wzorcowy (3.7.3) o stężeniu 1,0 µg/ml, aż do uzyskania stałych wysokości pików i czasów retencji.

5.3.2. Wykres kalibracyjny

Dozować kilkakrotnie każdy roztwór wzorcowy (3.7.3) i oznaczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracji, odkładając średnie wysokości pików roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia w µg/ml na osi odciętych.

5.3.3. Roztwór próbki

Dozować kilkakrotnie ekstrakt próbki (5.2), stosując takie same objętości jak dla roztworów wzorcowych, i oznaczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) amprolium.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Na podstawie średniej wysokości (powierzchni) pików amprolium dla roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w µg/ml, korzystając z wykresu kalibracyjnego (5.3.2). Zawartość amprolium w mg/kg próbki obliczyć według poniższego wzoru:

    V x d x f

w = ----------- [mg/kg],

       m

w którym:

V -   objętość roztworu do ekstrakcji (3.8), w ml, według (5.2) (np. 200 ml),

d -   stężenie amprolium w ekstrakcie próbki (5.2), w µg/ml,

f -   współczynnik rozcieńczania według (5.2),

m -   masa próbki analitycznej, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Tożsamość

Tożsamość analitu może być potwierdzona przez kochromatografię lub zastosowanie detektora diodowego, za pomocą którego porównuje się widma ekstraktu próbki (5.2) i roztworu wzorcowego (3.7.3) o stężeniu 2,0 µg/ml.

7.1.1. Kochromatografia

Do ekstraktu próbki (5.2) dodawana jest odpowiednia ilość roztworu wzorcowego (3.7.3). Ilość dodanego amprolium powinna być zbliżona do ilości amprolium znajdującego się w ekstrakcie próbki.

Tylko wysokość piku amprolium powinna się zwiększyć stosownie do dodanej ilości i stopnia rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10% szerokości piku amprolium w próbce przed dodaniem roztworu wzorcowego.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

(a)  Długość fali maksimum absorpcji dla spektrum próbki i wzorca, mierzona w szczytowym punkcie piku chromatogramu, powinna być taka sama, po uwzględnieniu marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcyjnego. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm.

(b)  Pomiędzy 210 a 320 nm spektra próbki i wzorca, zarejestrowane w szczytowym punkcie piku chromatogramu, nie powinny się różnić więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują takie same maksima i gdy odchylenia między tymi dwoma widmami we wszystkich obserwowanych punktach nie przekraczają 15% absorbancji wzorcowego analitu.

(c)  Pomiędzy 210 a 320 nm spektra narastającego zbocza, wierzchołka i obniżającego się zbocza pików uzyskiwanych z ekstraktów próbek nie powinny się różnić od siebie więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują te same maksima i gdy wszystkie obserwowane punkty odchyleń pomiędzy spektrami nie przekraczają 15% absorbancji najwyższego piku widma.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie została potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać:

-   15% względem wyższego wyniku dla zawartości amprolium od 25 mg/kg do 500 mg/kg,

-   0,75 mg/kg dla zawartości amprolium od 500 mg/kg do 1.000 mg/kg,

-   7,5% względem wyższego wyniku dla zawartości amprolium powyżej 1.000 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku fortyfikacji próbki paszy bez amprolium (ślepej) odzysk powinien wynosić co najmniej 90%.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Jeżeli próbka zawiera tiaminę, pik tiaminy na chromatogramie ukazuje się na krótko przed pikiem amprolium. W tej metodzie amprolium i tiamina muszą być rozdzielone. Jeżeli amprolium i tiamina nie zostaną rozdzielone w kolumnie (4.1.1) użytej w tej metodzie, należy zastąpić do 50% acetonitrylu w fazie ruchomej (3.6) metanolem.

8.2. Według British Pharmacopoeia widmo roztworu amprolium (c = 0,02 mol/l) w kwasie chlorowodorowym (c = 0,1 mol/l) wykazuje maksima przy 246 nm i 262 nm. Absorbancja powinna wynieść 0,84 przy 246 nm i 0,80 przy 262 nm.

8.3. Ekstrakt należy zawsze rozcieńczać fazą ruchomą, gdyż w przeciwnym razie czas retencji piku amprolium może się znacznie przesunąć, z uwagi na zmiany siły jonowej.

7.12. OZNACZANIE DIKLAZURILU

((+)-4-chlorofenylo[2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2-yl)fenylo]acetonitryl)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania diklazurilu w mieszankach paszowych i premiksach. Granica wykrywalności wynosi 0,1 mg/kg, granica oznaczalności 0,5 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Po dodaniu wzorca wewnętrznego próbka jest ekstrahowana zakwaszonym metanolem. W przypadku mieszanek paszowych, część ekstraktu jest oczyszczana przez ekstrakcję do fazy stałej z wykorzystaniem wkładu filtrującego C₁₈. Diklazuril jest eluowany z wkładu filtrującego zakwaszonym wodnym roztworem metanolu. Po odparowaniu pozostałość jest rozpuszczana w DMF/woda. W przypadku premiksów ekstrakt jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana w DMF/woda. Zawartość diklazurilu jest oznaczana metodą HPLC z odwróconą fazą i potrójnym gradientem przy zastosowaniu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Woda, o czystości do HPLC

3.2. Octan amonu

3.3. Kwaśny siarczan tetrabutyloamoniowy (TBHS)

3.4. Acetonitryl, o czystości do HPLC

3.5. Metanol, czysty do HPLC

3.6. N,N - dimetyloformamid (DMF)

3.7. Kwas chlorowodorowy, r₂₀ 1,19 g/ml

3.8. Substancja wzorcowa: diklazuril (+)-4-chlorofenylo[2,6-dichloro-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-diokso-l,2,4-triazyno-2-yl) fenylo]acetonitryl o gwarantowanej czystości, E 771

3.8.1. Roztwór wzorcowy podstawowy diklazurilu, 500 µg/ml

Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg diklazurilu (3.8) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (3.6), dopełnić do kreski DMF (3.6) i zamieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową lub użyć oranżowego szkła i przechowywać w lodówce. W temperaturze Ł 4°C roztwór jest stabilny przez jeden miesiąc.

3.8.2. Roztwór wzorcowy diklazurilu, 50 µg/ml

Przenieść 5,00 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.8.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, dopełnić do kreski DMF (3.6) i zamieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową lub użyć oranżowego szkła i przechowywać w lodówce. W temperaturze Ł 4°C roztwór jest stabilny przez jeden miesiąc.

3.9. Wzorzec wewnętrzny: 2,6-dichloro-a-(4-chlorofenylo)-4-(4,5dihydro-3,5-diokso-1,2,4-triazyno-2(3H)-yl)a-metylobenzeno-acetonitryl

3.9.1. Roztwór wzorca wewnętrznego, 500 µg/ml

Zważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg wzorca wewnętrznego (3.9) do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w DMF (3.6), dopełnić do kreski DMF (3.6) i zamieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową lub użyć oranżowego szkła i umieścić w lodówce. W temperaturze Ł 4°C roztwór jest stabilny przez jeden miesiąc.

3.9.2. Roztwór wzorca wewnętrznego, 50 µg/ml

Przenieść 5,00 ml wewnętrznego podstawowego wzorcowego roztworu (3.9.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do wymaganej objętości DMF (3.6) i wymieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową lub przelać do kolby z przyciemnionego szkła i umieścić w lodówce. W temperaturze Ł 4°C roztwór zachowuje stabilność przez 1 miesiąc.

3.9.3. Roztwór wzorca wewnętrznego do premiksów, p/1000 mg/ml (p = nominalna zawartość diklazurilu w premiksie w mg/kg)

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, p/10 mg wewnętrznej substancji wzorcowej do kolby miarowej o pojemności 100 ml, rozpuścić w DMF (3.6) w kąpieli ultradźwiękowej, uzupełnić DMF do wymaganej objętości i zamieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową lub przelać do kolby z przyciemnionego szkła i umieścić w lodówce. W temperaturze Ł 4°C roztwór zachowuje stabilność przez 1 miesiąc.

3.10. Roztwór wzorcowy kalibracyjny, 50 µg/ml

Odmierzyć pipetą 2,00 ml wzorcowego roztworu diklazurilu (3.8.2) i 2,00 ml wewnętrznego roztworu wzorcowego (3.9.2) do kolby z podziałką o pojemności 50 ml. Dodać 16 ml DMF (3.6), uzupełnić do znaku wodą i zamieszać. Roztwór należy sporządzać bezpośrednio przed użyciem.

3.11. Stały wkład ekstrakcyjny C₁₈, np. Bond Elut, wymiary: 1 cm³, masa sorbentu: 100 mg

3.12. Rozpuszczalnik ekstrakcyjny: zakwaszony metanol

Odmierzyć pipetą 5,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.7) do 1.000 ml metanolu (3.5) i wymieszać.

3.13. Faza ruchoma do HPLC

Eluent A: octan amonu - roztwór kwaśnego siarczanu tetrabutyloamonu

3.13.1. Rozpuścić 5 g octanu amonu (3.2) i 3,4 g TBHS (3.3) w 1000 ml wody (3.1)i zamieszać.

3.13.2. Eluent B: acetonitryl (3.4)

3.13.3. Eluent C: metanol (3.5)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Wstrząsarka mechaniczna

4.2. Sprzęt do HPLC z potrójnym gradientem

4.2.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, Hypersil ODS, wypełnienie 3 µm, 100 mm x 4,6 mm lub równoważne

4.2.2. Detektor UV ze zmienną długością fali lub detektor diodowy

4.3. Obrotowa wyparka próżniowa

4.4. Filtr membranowy 0,45 µm

4.5. Próżniowy przewód rozgałęźny

4.6. Łaźnia ultradźwiękowa

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próbka paszy

Należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy w celu upewnienia się, czy nie występują w niej diklazuril ani substancje zakłócające. Rodzaj ślepej próbki paszy powinien być podobny do rodzaju próbki badanej, a analiza powinna potwierdzić brak diklazurilu i substancji zakłócających.

5.1.2. Badanie odzysku

Badanie odzysku powinno być przeprowadzone na drodze analizy ślepej próbki paszy, do której dodano taką ilość diklazurilu, która występuje w próbce. W celu uzyskania zawartości na poziomie 1 mg/kg dodać 0,1 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.8.1) do 50 g ślepej próbki paszy, starannie wymieszać i pozostawić na 10 min, a następnie mieszać jeszcze kilkakrotnie przed użyciem (5.2).

Alternatywnie, gdy nie ma ślepej próbki paszy zbliżonej typem do próbki badanej (5.1.1), badanie odzysku można przeprowadzić, stosując metodę dodawania wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest wzbogacana diklazurilem, w ilości podobnej do występującej w próbce. Ta próbka ta jest analizowana razem z próbką bez zwiększonej zawartości diklazurilu, a odzysk może być obliczony przez odejmowanie.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Pasze

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 50 g próbki. Przenieść do 500 ml kolby stożkowej, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.9.2), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (4.1) przez całą noc. Pozostawić na 10 minut dla odstania. Przelać 20 ml sklarowanej cieczy do odpowiedniego szklanego naczynia i rozcieńczyć 20 ml wody. Przenieść roztwór na wkład ekstrakcyjny (3.11) i przepuścić przezeń, stosując podciśnienie (4.5). Przepłukać wkład 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego i wody, 65 + 35 (V + V). Odrzucić zebrane frakcje i eluować związki, stosując 25 ml mieszaniny rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i wody, 80 + 20 (V + V). Odparować tę frakcję do momentu osuszenia za pomocą wyparki obrotowej (4.3) w temperaturze 60°C. Rozpuścić suchą pozostałość w 1,0 ml DMF (3.6), dodać 1,5 ml wody (3.1) i wymieszać. Przesączyć przez sączek membranowy (4.4). Przystąpić do analizy HPLC (5.3).

5.2.2. Premiksy

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 1 g próbki. Przenieść do 500 ml kolby stożkowej, dodać 1,00 ml roztworu wzorca wewnętrznego (3.9.3), 200 ml rozpuszczalnika ekstrakcyjnego (3.12) i zamknąć kolbę korkiem. Wstrząsać mieszaninę na wstrząsarce (4.1) przez całą noc. Pozostawić na 10 minut dla odstania. Przenieść część 10000/p ml (p = nominalna zawartość diklazurilu w premiksie w mg/kg) sklarowanej cieczy nad osadem do kolby okrągłodennej o odpowiedniej pojemności. Odparować do momentu osiągania suchości, pod obniżonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C przy użyciu wyparki obrotowej (4.3). Ponownie rozpuścić suchą pozostałość w 10,0 ml DMF (3.6), dodać 15,0 ml wody (3.1) i wymieszać. Przystąpić do analizy HPLC (5.3).

5.3. Analiza HPLC

5.3.1. Parametry

Poniższe parametry podano jako przykładowe; inne warunki mogą być zastosowane pod warunkiem, że prowadzą do uzyskania podobnych wyników:

Kolumna chromatograficzna (4.2.1):    100 mm x 4,6 mm, Hypersil ODS

                                      wypełnienie 3 µm lub podobne

Faza ruchoma (3.9):                   Eluent A (3.13.1): wodny roztwór octanu amonu

                                      i kwaśnego siarczanu tetrabutyloamoniowego

                                      Eluent B (3.12.2): acetonitryl

                                      Eluent C (3.13.3): metanol

Sposób elucji:                        - gradient liniowy

                                      - warunki początkowe: A + B + C =

                                      60 + 20 + 20 (v + v + v)

                                      - po 10 min elucja gradientowa przez 30 min

                                      do: A + B + C = 45 + 20 + 35 (v + v + v)

                                      Płukać eluentem B przez 10 min.

Przepływ:                                    1,5 - 2 ml/min

Dozowana objętość:                           20 µl

Długość fali przy detekcji:                  280 nm

Określić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.10) o stężeniu 2,0 µg/ml, aż do uzyskania pików o stałej wysokości i powtarzalnych czasach retencji.

5.3.2. Roztwór kalibracyjny

Wprowadzić kilkakrotnie 20 µl roztworu kalibracyjnego (3.10) i oznaczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) dla diklazurilu i wzorca wewnętrznego.

5.3.3. Roztwór próbki

Dozować kilkakrotnie 20 µl roztworu próbki ((5.2.1) lub (5.2.2)) i oznaczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) dla diklazurilu i wzorca wewnętrznego.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

6.1. Mieszanki paszowe

Zawartość diklazurilu w próbce, w mg/kg, obliczyć według wzoru:

    h_d,s x h_i,c     d_d,c x 10 V

w = ------------- x ------------ [mg/kg],

    h_i,s x h_d,c          m

gdzie:

h_d,s -  wysokość piku (powierzchnia) diklazurilu w roztworze próbki (5.2.1),

h_i,s -  wysokość piku (powierzchnia) wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (5.2.1),

h_d,c -  wysokość piku (powierzchnia) diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10),

h_i,c -  wysokość piku (powierzchnia) wzorca wewnętrznego w roztworze kalibracyjnym (3.10),

d_d,c -  stężenie diklazurilu w roztworze kalibracyjnym, w µg/ml (3.10),

m -    masa próbki analitycznej, w g,

V -    objętość ekstraktu próbki według (5.2.1) (tj. 2,5 ml).

6.2. Premiksy

Zawartość diklazurilu w próbce, w mg/kg, obliczyć według wzoru:

    h_d,s x h_i,c    d_d,c x 0,02 V x p

W = ------------- x ------------------ [mg/kg],

    h_i,s x h_d,c             m

gdzie:

h_d,c -  wysokość piku (powierzchnia) diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10),

h_i,c -  wysokość piku (powierzchnia) wzorca wewnętrznego w roztworze kalibracyjnym (3.10),

h_d,s -  wysokość piku (powierzchnia) diklazurilu w roztworze próbki (5.2.2 ),

h_i,s -  wysokość piku (powierzchnia) wzorca wewnętrznego w roztworze próbki (5.2.2),

d_d,c -  stężenie diklazurilu w roztworze kalibracyjnym (3.10),

m -    masa odważki analitycznej, w g,

V -    objętość ekstraktu próbki według (5.2.2) (tj. 25 ml),

p -    nominalna zawartość diklazurilu w premiksie, w mg/kg.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Tożsamość

Tożsamość substancji analizowanej może być potwierdzona przez równoległą chromatografię (kochromatografia) lub zastosowanie detektora diodowego, za pomocą którego porównuje się widma ekstraktu próbki ((5.2.1) lub (5.2.2)) i roztworu kalibracyjnego (3.10).

7.1.1. Kochromatografia

Ekstrakt próbki ((5.2.1) lub (5.2.2)) jest wzbogacany przez dodatek odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.10). Ilość dodanego diklazurilu powinna być podobna do ilości diklazurilu znajdującej się w ekstrakcie próbki.

Tylko wysokość piku diklazurilu i piku wzorca wewnętrznego powinna wzrastać po uwzględnieniu dodanej ilości i stopnia rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach ± 10% szerokości pierwotnej piku diklazurilu lub wzorca wewnętrznego w stosunku do piku ekstraktu próbki.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki sprawdza się według następujących kryteriów:

(a)  Długość fali maksimum absorpcji dla spektrum próbki i wzorca, mierzona w szczytowym punkcie piku chromatogramu, powinna być taka sama, po uwzględnieniu marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcyjnego. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm.

(b)  Pomiędzy 230 a 320 nm spektra próbki i wzorca, zarejestrowane w szczytowym punkcie piku chromatogramu, nie powinny się różnić więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują takie same maksima i gdy odchylenia miedzy tymi dwoma widmami we wszystkich obserwowanych punktach nie przekraczają 15% absorbancji wzorcowego analitu.

(c)  Pomiędzy 230 a 320 nm spektra narastającego zbocza, wierzchołka i obniżającego się zbocza pików uzyskiwanych z ekstraktów próbek nie powinny się różnić od siebie więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują te same maksima i gdy wszystkie obserwowane punkty odchyleń pomiędzy spektrami nie przekraczają 15% absorbancji najwyższego piku widma.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie została potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać:

- 30% względem wyższej zawartości diklazurilu w przedziale od 0,5 mg/kg do 2,5 mg/kg,

- 0,75 mg/kg dla zawartości diklazurilu pomiędzy 2,5 mg/kg i 5 mg/kg,

- 15% względem wyższej zawartości diklazurilu powyżej 5 mg/kg.

7.3. Odzysk

W przypadku wzbogaconej (ślepej) próbki odzysk powinien wynosić co najmniej 80%.

8. OBJAŚNIENIA

Należy uprzednio sprawdzić, czy wysokości (powierzchnie) pików diklazurilu zmieniają się liniowo w zakresie mierzonych stężeń.

7.13. OZNACZANIE KARBADOKSU

(metylo 3-(2-chinoksalinylometyleno)pikrynian N¹,N⁴-ditlenek)

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania karbadoksu w paszach, premiksach i preparatach. Granica wykrywalności wynosi 0,1 mg/kg, a granica oznaczalności wynosi 10 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka jest zwilżana wodą i poddawana ekstrakcji za pomocą mieszaniny metanol - acetonitryl. W przypadku mieszanek paszowych część przesączonego ekstraktu zostaje oczyszczona w kolumnie z tlenkiem glinu. W przypadku premiksów i preparatów część przesączonego ekstraktu zostaje rozcieńczona do odpowiedniego stężenia wodą, metanolem i acetonitrylem. Zawartość karbadoksu oznacza się metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej o odwróconej fazie (HPLC) przy użyciu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Metanol

3.2. Acetonitryl, klasy HPLC

3.3. Kwas octowy, w = 100%

3.4. Tlenek glinu: obojętny, stopień aktywności I

3.5. Metanol - acetonitryl 1 + 1 (v + v)

Zmieszać 500 ml metanolu (3.1) z 500 ml acetonitrylu (3.2).

3.6. Kwas octowy, s = 10%

Rozcieńczyć 10 ml kwasu octowego (3.3) wodą do 100 ml.

3.7. Octan sodu, CH₃COONa

3.8. Woda o czystości do HPLC

3.9. Roztwór buforowy octanowy, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0

Rozpuścić 0,82 g octanu sodu (3.7) w 700 ml wody (3.8) i doprowadzić pH do 6,0 kwasem octowym (3.6). Przenieść do 1.000 ml kolby miarowej, uzupełnić wodą (3.8) do kreski i wymieszać.

3.10. Faza ruchoma do HPLC

Zmieszać 825 ml roztworu buforu octanowego (3.9) i 175 ml acetonitrylu (3.2). Przesączyć przez sączek przeponowy 0,22 µm (4.5) i odgazować roztwór (np. w łaźni ultradźwiękowej przez 10 minut).

3.11. Substancja wzorcowa: czysty karbadoks: metylo 3-(2-chinoksalinylometyleno)pikrynian N¹,N⁴-ditlenek, E 850

3.11.1. Wzorcowy podstawowy roztwór karbadoksu, 100 µg/ml (5)

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 25 mg wzorca karbadoksu (3.11) do kolby miarowej o pojemności 250 ml. Rozpuścić w mieszaninie metanol - acetonitryl (3.5) w łaźni ultradźwiękowej (4.7). Po działaniu ultradźwięków doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić do kreski mieszaniną metanol - acetonitryl (3.5) i zamieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową lub użyć szkła oranżowego i umieścić w lodówce. W temperaturze Ł 4°C roztwór zachowuje stabilność przez l miesiąc.

3.11.2. Roztwory wzorcowe kalibracyjne

Przenieść 2,0; 5,0; 10,0 i 20,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.11.1) do kilku kolb miarowych o pojemności 100 ml. Dodać 30 ml wody, uzupełnić do kreski mieszaniną metanol - acetonitryl (3.5) i zamieszać. Zawinąć kolbę w folię aluminiową. Roztwory te odpowiadają 2,0; 5,0; 10,0 i 20,0 µg/ml karbadoksu. Roztwory wzorcowe należy sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

W celu oznaczenia karbadoksu w mieszankach paszowych zawierających poniżej 10 mg/kg należy użyć roztworów wzorcowych o stężeniu poniżej 2,0 µg/ml.

3.12. Mieszanina woda - [metanol - acetonitryl] (3.5), 300 + 700 (v + v)

Zmieszać 300 ml wody z 700 ml mieszaniny metanol - acetonitryl (3.5).

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Wstrząsarka laboratoryjna lub mieszadło magnetyczne

4.2. Sączek papierowy z włóknem szklanym (Whatman GF/A lub podobny)

4.3. Szklana kolumna (długość 300 do 400 mm, wewnętrzna średnica około 10 mm) ze spiekiem szklanym oraz zaworem odpływowym

Można użyć również kolumny szklanej z kurkiem lub ze ściętym końcem; w takim przypadku w dolnym końcu umieszcza się zwitek waty szklanej, ubity szklanym prętem.

4.4. Sprzęt do HPLC z dozownikiem umożliwiającym dozowanie 20 µl

4.4.1. Kolumna do chromatografii cieczowej: 300 mm x 4 mm, C₁₈, wypełnienie 10 µm lub równoważne

4.4.2. Detektor UV z regulacją długości fal lub detektor diodowy pracujący w zakresie 225 do 400 nm

4.5. Sączek membranowy, 0,22 µm

4.6. Sączek membranowy, 0,45 µm

4.7. Łaźnia ultradźwiękowa

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Karbadoks jest wrażliwy na działanie światła. Wszystkie czynności wykonywać przy słabym świetle lub używać szkła oranżowego, lub owijać szkło folią aluminiową.

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Ślepa próbka paszy

Dla potrzeb przeprowadzenia testu odzysku należy przeprowadzić analizę ślepej próbki paszy w celu upewnienia się, czy nie występują w niej karbadoks i substancje zakłócające. Rodzaj ślepej próbki paszy powinien być podobny do rodzaju próbki, a analiza powinna potwierdzić brak karbadoksu i substancji zakłócających.

5.1.2. Badanie odzysku

Badanie odzysku powinno być przeprowadzone na drodze analizy ślepej próbki paszy, do której dodano pewną ilość karbadoksu, podobną do już występującej w próbce. W celu uzyskania zawartości na poziomie 50 mg/kg dodać 5,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.11.1) do kolby stożkowej 200 g. Odparować roztwór w strumieniu azotu. Dodać 10 g ślepej próbki paszy, starannie wymieszać i pozostawić na 10 min przed przejściem do etapu ekstrakcji (5.2).

Jeżeli nie istnieje ślepa próbka paszy zbliżona typem do próbki badanej (5.1.1), badanie odzysku można przeprowadzić, stosując metodę dodatku wzorca. W tym przypadku przeznaczona do analizy próbka jest uzupełniana pewną ilością karbadoksu podobną do już obecnej w próbce. Próbka ta jest poddawana analizie wraz z próbką bez zwiększonej zawartości karbadoksu i odzysk może być obliczony przez odejmowanie.

5.2. Ekstrakcja

5.2.1. Mieszanki paszowe

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 10 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 200 ml, dodać 15,0 ml wody, wymieszać i równoważyć przez 5 minut. Dodać 35,0 ml mieszaniny metanol - acetonitryl (3.5), zamknąć korkiem i wstrząsać przez 30 minut na wstrząsarce lub mieszać na mieszadle magnetycznym (4.1). Przesączyć ekstrakt przez sączek papierowy z włóknem szklanym (4.2). Zachować ten roztwór do etapu oczyszczania (5.3).

5.2.2. Premiksy (0,1 do 2,0%)

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 1 g niezmielonej próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 200 ml, dodać 15,0 ml wody, wymieszać i równoważyć przez 5 minut. Dodać 35 ml metanolu - acetonitrylu 1 + 1 (v + v) (3.5), zamknąć korkiem i pozostawić mieszaninę na wstrząsarce (4.1). Przefiltrować na sączku papierowym z włóknem szklanym (4.2). Pipetą przenieść część przesączonego ekstraktu do 50 ml kolby miarowej. Dodać 15 ml wody, uzupełnić do kreski metanolem z acetonitrylem (3.5) i wymieszać. Stężenie karbadoksu w roztworze końcowym powinno wynieść około 10 µg/ml. Część roztworu sączona jest przez sączek 0,45 µm (4.6). Przystąpić do analizy HPLC (5.4).

5.2.3. Preparaty (> 2,0%)

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 0,1 g niezmielonej próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 250 ml, dodać 45,0 ml wody, wymieszać i równoważyć przez 5 minut. Dodać 105 ml metanolu - acetonitrylu (3.5), zamknąć korkiem, poddawać działaniu ultradźwięków przez 15 minut i pozostawić mieszaninę na wstrząsarce (4.1) na 15 minut. Przesączyć przez sączek papierowy z włóknem szklanym (4.2). Rozcieńczyć część przesączonego ekstraktu mieszaniną wody, metanolu i acetonitrylu (3.5) do ostatecznego stężenia karbadoksu 10 - 15 µg/ml (w preparatach o 10% zawartości karbadoksu współczynnik rozcieńczania wynosi 10). Część ekstraktu przesączyć przez sączek 0,45 µm (4.6). Przystąpić do analizy HPLC (5.4).

5.3. Oczyszczanie

5.3.1. Przygotowanie kolumny tlenku glinu

Odważyć 4 g tlenku glinu (3.4) i przenieść do szklanej kolumny (4.3).

5.3.2. Czyszczenie próbki

Umieścić 15 ml odfiltrowanego ekstraktu (5.2.1) w kolumnie z tlenkiem glinu i usunąć pierwsze 2 ml eluatu. Pobrać następne 5 ml i przesączyć część roztworu przez sączek 0,45 µm (4.6). Przystąpić do analizy HPLC (5.4).

5.4. Analiza HPLC

5.4.1. Warunki oznaczania

Poniższe warunki oznaczania podano jako przykładowe; inne warunki mogą być wykorzystane pod warunkiem, że prowadzą do uzyskania podobnych wyników:

Kolumna chromatograficzna (4.1.1):    300 mm x 4 mm, faza odwrócona C₁₈,

                                      wypełnienie 10 µm lub podobne

Faza ruchoma (3.10):                  Mieszanina buforu octanowego (3.9)

                                      i acetonitrylu (3.2), 825 + 175 (V + V)

Przepływ:                             1,5-2 ml/min

Długość fali przy detekcji:           365 nm

Dozowana objętość:                    20 µl

Określić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.11.2) o stężeniu 5,0 µg/ml, aż do uzyskania pików o stałej wysokości (lub powierzchni) i powtarzalnych czasach retencji.

5.4.2. Krzywa kalibracyjna

Dozować kilkakrotnie każdy roztwór wzorcowy (3.11.2) i oznaczyć średnią wysokość piku (powierzchnię) dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracji, odkładając średnie wysokości pików lub powierzchnie roztworów kalibracyjnych na osi rzędnych oraz odpowiadające im stężenia, w µg/ml, na osi odciętych.

5.4.3. Roztwór próbki

Dozować kilkakrotnie ekstrakt próbki (5.3.2) pasz, premiksów (5.2.2) i preparatów (5.3.2) i oznaczyć średnią wysokość (powierzchnię) pików karbadoksu.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Na podstawie średnich wysokości (powierzchni) pików karbadoksu roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w µg/ml z wykresu kalibracyjnego (5.4.2).

6.1. Mieszanki paszowe

Zawartość karbadoksu w próbce, wyrażoną w mg/kg, obliczyć według wzoru:

    d x V_8hl

w = ---------- [mg/kg],

      m

gdzie:

d -   stężenie karbadoksu w ekstrakcie próbki (5.3.2), w µg/ml,

V₁ -  objętość ekstraktu próbki, w ml (tzn. 50),

m -   masa próbki analitycznej, w g.

6.2. Premiksy i preparaty

Zawartość karbadoksu w próbce, wyrażoną w mg/kg, obliczyć według wzoru:

    d x V₂ x f

w = ------------ [mg/kg],

        m

gdzie:

d -   stężenie karbadoksu w ekstrakcie próbki ((5.2.2) lub (5.2.3)), w µg/ml,

V₂ -  objętość ekstraktu próbki, w ml (tzn. 50 dla premiksów; 150 dla preparatów),

f -   współczynnik rozcieńczenia wg (5.2.2) (premiksy) lub (5.2.3) (preparaty),

m -   masa próbki analitycznej, w g.

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Tożsamość

Tożsamość analizowanej substancji może być potwierdzona przez równoległą chromatografię (kochromatografia) lub zastosowanie detektora diodowego, za pomocą którego porównuje się widma ekstraktu próbki ((5.2.1) lub (5.2.2)) i roztworu kalibracyjnego (3.10) o stężeniu karbadoksu 10,0 µg/ml.

7.1.1. Kochromatografia

Do ekstraktu próbki dodawana jest odpowiednia ilość roztworu wzorcowego. Ilość dodanego karbadoksu powinna być zbliżona do ilości karbadoksu stwierdzonej w ekstrakcie próbki.

Tylko wysokość piku karbadoksu powinna być zwiększona stosownie do dodanej ilości wzorca i stopnia rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie jego wysokości musi mieścić się w granicach 10% szerokości pierwotnej.

7.1.2. Detekcja diodowa

Wyniki ocenia się według następujących kryteriów:

(a)  Długość fali maksimum absorpcji dla spektrum próbki i wzorca, mierzona w szczytowym punkcie piku chromatogramu, powinna być taka sama, po uwzględnieniu marginesu określonego zdolnością rozdzielczą systemu detekcyjnego. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza mieści się zazwyczaj w granicach 2 nm.

(b)  Pomiędzy 225 a 400 nm spektra próbki i wzorca, zarejestrowane w szczytowym punkcie piku chromatogramu, nie powinny się różnić więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują takie same maksima i gdy odchylenia miedzy tymi dwoma widmami we wszystkich obserwowanych punktach nie przekraczają 15% absorbancji wzorcowego analitu.

(c)  Pomiędzy 225 a 400 nm spektra narastającego zbocza, wierzchołka i obniżającego się zbocza pików uzyskiwanych z ekstraktów próbek nie powinny się różnić od siebie więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują te same maksima i gdy wszystkie obserwowane punkty odchyleń pomiędzy spektrami nie przekraczają 15% absorbancji najwyższego piku widma.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie została potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Dla zawartości 10 mg/kg i wyższej różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać 15% w odniesieniu do wyższego wyniku.

7.3. Odzysk

Dla wzbogaconej próbki (ślepej) odzysk powinien wynosić co najmniej 90%.

7.14. OZNACZANIE OLAQUINDOKSU

(2-[N-2'-(hydroksyetyl)karbamoil]-3-metylochinoksalino-N¹,N⁴-dioksyd)

1. CEL I ZAKRES

Opisano metodę oznaczania olaquindoksu w paszach. Dolna granica oznaczalności metody wynosi 5 mg/kg.

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowana mieszaniną woda - metanol. Zawartość olaquindoksu jest oznaczana metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) w fazie odwróconej przy użyciu detektora UV.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Metanol

3.2. Metanol, czysty do HPLC

3.3. Woda, czysta do HPLC

3.4. Faza ruchoma do HPLC:

Mieszanina: woda (3.3) - metanol (3.2), 900 + 100 (V + V).

3.5. Substancja wzorcowa: czysty olaquindoks (2-[N-2'-(hydroksyetyl)karbamoil]-3-metylochinoksalino-N¹,N⁴-dioksyd, E 851

3.5.1. Podstawowy roztwór wzorcowy olaquindoksu, 250 µg/ml

Odważyć, z dokładnością do 0,1 mg, 50 mg olaquindoksu (3.5) do kolby pomiarowej o pojemności 200 ml i dodać około 190 ml wody. Następnie umieścić kolbę w łaźni ultradźwiękowej (4.1) na 20 minut. Po obróbce ultradźwiękami doprowadzić roztwór do temperatury pokojowej, uzupełnić wodą do kreski i wymieszać. Przykryć kolbę folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Roztwór powinien być przygotowywany na świeżo każdego miesiąca.

3.5.2. Pośredni roztwór standardowy olaquindoksu, 25 µg/ml

Przenieść 10 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.5.1) do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml, uzupełnić do kreski fazą ruchomą (3.4) i wymieszać. Przykryć kolbę folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Roztwór powinien być przygotowywany na świeżo każdego dnia.

3.5.3. Roztwory kalibracyjne

Do serii kolb pomiarowych o pojemności 50 ml przenieść 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0 i 20,0 ml pośredniego roztworu wzorcowego (3.5.2.). Uzupełnić do kreski fazą ruchomą (3.4) i wymieszać. Przykryć kolbę folią aluminiową i przechowywać w lodówce. Roztwory te odpowiadają odpowiednio 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 7,5, i 10 µg olaquindoksu / ml.

Roztwory powinny być przygotowywane na świeżo każdego dnia.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Łaźnia ultradźwiękowa

4.2. Wstrząsarka mechaniczna

4.3. Aparat do HPLC z detektorem o zmiennej długości fali lub detektorem diodowym

4.3.1. Kolumna do chromatografii cieczowej, 250 mm x 4 mm, wypełnienie C₁₈, 10 µm lub równoważne

4.4. Sączek membranowy, 0,45 µm

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Olaquindoks jest wrażliwy na światło. Prowadzić całe postępowanie przy ograniczonym dostępie światła lub używając szkła oranżowego.

5.1. Wskazówki ogólne

5.1.1. Należy poddać analizie ślepą próbkę paszy celem potwierdzenia braku olaquindoksu i substancji interferujących.

5.1.2. Badanie odzysku należy przeprowadzić, poddając analizie ślepą próbkę paszy z dodatkiem znanej ilości olaquindoksu, podobnej do tej, która występuje w badanej próbce. W celu wprowadzenia dodatku na poziomie 50 mg/kg przenieść 10 ml podstawowego roztworu wzorcowego (3.5.1) do kolby stożkowej o pojemności 250 ml i odparować roztwór do około 0,5 ml. Dodać 50 g wyjściowej paszy bez olaquindoksu, dokładnie wymieszać i pozostawić na 10 min, kilkakrotnie mieszając przed przystąpieniem do etapu ekstrakcji (5.2).

W celu właściwego wykonania analizy ślepa próbka paszy powinna być typu podobnego do badanych próbek, a olaquindoks nie powinien być w niej obecny.

5.2. Ekstrakcja

Odważyć, z dokładnością 0,01 g, około 50 g próbki. Przenieść do kolby stożkowej o pojemności 1.000 ml, dodać 100 ml metanolu (3.1) i umieścić na 5 minut w łaźni ultradźwiękowej (4.1). Dodać 410 ml wody i pozostawić w łaźni ultradźwiękowej na następne 15 minut. Przenieść kolbę z łaźni i wstrząsać przez 30 minut przy użyciu wstrząsarki mechanicznej (4.2), następnie przesączyć przez pofałdowany sączek. Przenieść 10 ml przesączu do kolby pomiarowej o pojemności 20 ml, uzupełnić wodą do kreski i zamieszać. Przesączyć część roztworu przez sączek membranowy (4.4), uwzględnić (9). Przystąpić do analizy HPLC (5.3).

5.3. Analiza HPLC

5.3.1. Warunki oznaczania

Poniższe warunki oznaczania podano jako przykładowe; inne parametry mogą być wykorzystane pod warunkiem, że prowadzą do uzyskania podobnych wyników:

Kolumna chromatograficzna (4.3.1)

Faza ruchoma (3.4):                   mieszanina woda (3.3) - metanol (3.2),

                                      900+100(V + V)

Przepływ:                             1,5-2 ml/min

Długość fali przy detekcji:           380 nm

Dozowana objętość:                    20 µl - 100 µl.

Określić stabilność systemu chromatograficznego, dozując kilkakrotnie roztwór kalibracyjny (3.5.3) o stężeniu 2,5 µg/ml, aż do uzyskania pików o stałej wysokości i powtarzalnych czasach retencji.

5.3.2. Krzywa kalibracyjna

Dozować każdy kalibracyjny roztwór (3.5.3) kilka razy i określić średnią wysokość piku (pole powierzchni) dla każdego stężenia. Wykreślić krzywą kalibracyjną, zaznaczając średnie wysokości pików (pola powierzchni) na osi rzędnych i odpowiadające im stężenia w µg/ml na osi odciętych.

5.3.3. Roztwór próbki

Dozować ekstrakt próbki (5.2) kilka razy, stosując taką samą objętość jak przy roztworach kalibracyjnych, i określić średnią wysokość (pole powierzchni) pików olaquindoksu.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Na podstawie średniej wysokości pików (pola powierzchni) olaquindoksu roztworu próbki określić stężenie roztworu próbki w µg/ml z krzywej kalibracyjnej (5.3.2).

Zawartość olaquindoksu, w mg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

   c x 1.000

w = ----------,

       m

w którym:

c -   stężenie olaquindoksu w ekstrakcie próbki (5.2), w µg/ml,

m -   masa próbki analitycznej, w g (5.2).

7. SPRAWDZENIE METODY

7.1. Tożsamość

Tożsamość analitu może być potwierdzona za pomocą kochromatografii lub po zastosowaniu detektora diodowego, w którym spektra ekstraktu próbki (5.2) i roztworu kalibracyjnego (3.5.3) o stężeniu 5 µg/ml są porównywane.

7.1.1. Kochromatografia

Ekstrakt próbki (5.2) jest wzbogacony przez dodatek odpowiedniej ilości roztworu kalibracyjnego (3.5.3). Ilość dodanego olaquindoksu powinna być podobna do ilości olaquindoksu w ekstrakcie próbki. Tylko wysokość piku olaquindoksu powinna wzrosnąć w stopniu zależnym od ilości dodanego olaquindoksu i rozcieńczenia ekstraktu. Szerokość piku w połowie wysokości powinna odpowiadać z dokładnością ±10% szerokości piku oryginalnej próbki otrzymanej z badanego ekstraktu.

7.1.2. Detekcja z użyciem detektora diodowego

Wyniki są oceniane zgodnie z następującymi kryteriami:

(a)  Długość fali, przy której występuje maksimum absorpcji próby i wzorca, oznaczona w szczytowym punkcie piku chromatogramu, nie powinna przekraczać zdolności rozdzielczej systemu detekcji. Dla detektora diodowego zdolność rozdzielcza wynosi ± 2 nm.

(b)  Pomiędzy 220 i 400 nm spektra próbki i wzorca, rejestrowane w szczytowym punkcie piku chromatografu, nie powinny się różnić więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują takie same maksima i gdy odchylenia między tymi dwoma widmami we wszystkich obserwowanych punktach nie przekraczają 15% absorbancji wzorcowego analitu.

(c)  Pomiędzy 220 a 400 nm spektra narastającego zbocza, wierzchołka i obniżającego się zbocza pików uzyskiwanych z ekstraktów próbek nie powinny się różnić od siebie więcej niż w przedziale 10 - 100% względnej absorbancji. To kryterium jest spełnione, gdy występują te same maksima i gdy wszystkie obserwowane punkty odchyleń pomiędzy spektrami nie przekraczają 15% absorbancji najwyższego piku widma.

Jeżeli jedno z tych kryteriów nie jest spełnione, obecność analitu nie została potwierdzona.

7.2. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń tej samej próbki nie może przekraczać 15% wartości względnej w odniesieniu do wyższego wyniku dla zawartości olaquindoksu w zakresie od 10 mg/kg do 20 mg/kg;

7.3. Odzysk

Odzysk olaquindoksu dodanego do ślepej próbki paszy nie może być niższy od 90%.

8. OBJAŚNIENIA

Chociaż metoda nie była sprawdzana dla pasz zawierających więcej niż 100 mg/kg olaquindoksu, jednak jest możliwe otrzymanie zadowalających wyników poprzez zmniejszenie odważki analitycznej i/lub rozcieńczenie ekstraktu (5.2) celem otrzymania stężenia w zakresie krzywej wzorcowej (5.3.2).

7.15. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI NARAZYNY METODĄ MIKROBIOLOGICZNĄ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania narazyny w preparatach handlowych, premiksach, koncentratach i mieszankach paszowych.

2. ZASADA METODY

Metoda polega na pomiarze średnicy stref zahamowania wzrostu szczepu testowego Bacillus subtilis ATCC 6633 i obliczeniu na tej podstawie zawartości soli sodowej narazyny.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

W przypadku stosowania roztworów sterylnych sterylizację należy prowadzić w autoklawie w temperaturze 121°C przez 15 min. Szkło należy sterylizować w temperaturze od 170°C do 175°C przez 1 h.

Stosować następujące odczynniki i roztwory:

3.1. Substancja wzorcowa - narazyna o znanej aktywności

3.2. Alkohol metylowy, roztwór 10% (V/V)

3.3. Alkohol metylowy, roztwór 50% (V/V)

3.4. Alkohol metylowy, roztwór 90% (V/V)

3.5. Alkohol metylowy bezwodny

3.6. Płyn fizjologiczny - chlorek sodu - roztwór 0,9% (m/m)

3.7. Kwas chlorowodorowy, roztwór o c (HCl) = 1 mol/l

3.8. Wodorotlenek sodu, roztwór o c (NaOH) = 1 mol/l

3.9. Tritlenek diglinu, granulowany - obojętny

4. APARATURA I SPRZĘT

Przy oznaczaniu należy stosować następującą aparaturę i przyrządy:

4.1. Autoklaw

4.2. Cieplarka

4.3. Wstrząsarka laboratoryjna

4.4. Pehametr

4.5. Wirówka

4.6. Przyrząd do pomiaru stref zahamowania lub suwmiarka

4.7. Butelki Roux

4.8. Korkobór o średnicy 10 mm

4.9. Płytki Petriego o średnicy 12 cm i równym dnie

4.10. Szklane kolumny chromatograficzne o długości 40 cm i średnicy wewnętrznej 25 mm

4.11. Mikropipety o różnej pojemności

5. POŻYWKI I SZCZEP TESTOWY

5.1. Pożywka do hodowli i przechowywania szczepu testowego

trypton                               10,0 g

ekstrakt drożdżowy                    3,0 g

ekstrakt mięsny                       1,5 g

glukoza                               1,0 g

agar                                  15,0 g

woda do                               1.000 ml.

Składniki wymieszać i upłynnić, podgrzewając. Ustalić pH pożywki za pomocą roztworów wodorotlenku sodu (3.8) lub kwasu chlorowodorowego (3.7) tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,5. Wlać po około 300 ml do butelek Roux i po około 7 ml do probówek bakteriologicznych. Sterylizować. Butelki Roux ustawić w pozycji poziomej, a probówki w pozycji ukośnej, aż do zastygnięcia podłoża, uzyskując w probówkach skos agarowy. Można stosować gotowe podłoże antybiotykowe nr 2.

5.2. Pożywka agarowa do wykonania oznaczania

glukoza                               10,0 g

ekstrakt drożdżowy                    2,5 g

wodorofosforan dipotasu (K₂HPO₄)      0,69 g

diwodorofosforan potasu (KH₂PO₄)      0,45 g

agar                                  15,0 g

woda do                               1.000 ml.

Składniki wymieszać i upłynnić, podgrzewając. Ustalić pH pożywki za pomocą roztworów wodorotlenku sodu (3.8) lub kwasu chlorowodorowego (3.7) tak, aby po sterylizacji wynosiło 6,0. Wlać do kolb stożkowych w ilości potrzebnej do jednorazowego użytku. Sterylizować.

5.3. Hodowla szczepu testowego Bacillus subtilis ATCC 6633

Na skos agarowy (5.1) posiać szczep testowy Bacillus subtilis ATCC 6633 i inkubować od 18 h do 24 h w temperaturze 30°C. Hodowlę bakteryjną przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C i przed upływem miesiąca przesiać na świeży skos agarowy.

5.4. Przygotowanie zawiesiny zarodników szczepu testowego Bacillus subtilis ATCC 6633

Skos agarowy ze świeżo wyhodowanym szczepem testowym (5.3) zmyć za pomocą 2 ml płynu fizjologicznego (3.6), używając oczka bakteriologicznego. Uzyskaną zawiesinę przenieść na podłoże do butelki Roux (5.1) i równomiernie rozprowadzić po całej powierzchni podłoża, używając sterylnych perełek szklanych. Inkubować od pięciu do siedmiu dni w temperaturze 30°C. Po okresie inkubacji zmyć hodowlę 30 ml płynu fizjologicznego (3.6). Zawiesinę ogrzewać przez 30 min w temperaturze 70°C. Przemyć trzy razy porcjami po 25 ml płynu fizjologicznego (3.6), każdorazowo odwirowując przez 5 min przy 3.000 obr/min i ramieniu wirówki r = 0,25 m. Po ostatnim odwirowaniu osad zawiesić w 30 ml płynu fizjologicznego (3.6) i ogrzewać ponownie przez 30 min w temperaturze 70°C. Tak przygotowana zawiesina może być przechowywana w lodówce w temperaturze 4°C przez pięć miesięcy.

5.5. Określenie optymalnej ilości zawiesiny zarodników szczepu testowego w pożywce agarowej do wykonania oznaczania

Pożywkę w kolbie przygotowaną według (5.2) upłynnić na łaźni wodnej i wlać po 30 ml do trzech kolb stożkowych o pojemności 100 ml. Do każdej kolby z pożywką ochłodzoną do temperatury 50°C wprowadzić następujące ilości zawiesiny zarodników szczepu testowego: 0,01 ml, 0,05 ml, 0,1 ml. Zawartość kolb dobrze wymieszać i wylać na płytki Petriego w ilości 18 ml na każdą płytkę.

Następnie wyciąć w agarze na każdej płytce po cztery studzienki i nanieść roztwór wzorcowy narazyny o stężeniu 0,25 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1,0 µg/ml, 2,0 µg/ml. Płytki pozostawić przez 1 h na stole laboratoryjnym, a następnie przenieść do cieplarki i inkubować od 16 h do 18 h w temperaturze 30°C. Po inkubacji ocenić wielkość i ostrość stref zahamowania wzrostu i wybrać optymalną ilość zawiesiny, która będzie stosowana w badaniach. Optymalna jest ta ilość zawiesiny, przy której uzyskuje się wyraźne strefy zahamowania wzrostu o następujących średnicach:

S₁ - 0,25 µg/ml - około 15 mm,

S₂ - 0,5 µg/ml - około 18 mm,

S₃ - 1,0 µg/ml - około 21 mm,

S₄ - 2,0 µg/ml - około 24 mm.

6. PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW WZORCOWYCH

6.1. Roztwór wzorcowy podstawowy

Odważyć z dokładnością do 0,01 mg taką ilość wzorca narazyny o znanej aktywności, aby po rozpuszczeniu w bezwodnym alkoholu metylowym (3.5) otrzymać roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Trwałość roztworu przechowywanego w temperaturze 4°C wynosi siedem dni.

6.2. Roztwory wzorcowe robocze

Z roztworu wzorcowego podstawowego przygotowanego według (2.5.1) sporządzić w dniu wykonania oznaczania roztwory wzorcowe robocze o stężeniach: 0,25 µg/ml (S₁), 0,5 µg/ml (S₂), 1,0 µg/ml (S₃), 2,0 µg/ml (S₄). Rozcieńczać alkoholem metylowym metodą kolejnych rozcieńczeń w stosunku 1 + 1.

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Przygotowanie ekstraktów analizowanych próbek

7.1.1. Przygotowanie ekstraktu z preparatu

Sporządzić, z dokładnością do 0,001 g, odważkę 1 g, preparatu handlowego i umieścić w kolbie stożkowej ze szlifem, o pojemności 250 ml. Dodać 100 ml alkoholu metylowego (3.4) i wstrząsać 30 min. Ekstrakt przesączyć i rozcieńczyć alkoholem metylowym (3.3) do stężenia 2,0 µg/ml.

7.1.2. Przygotowanie ekstraktów z premiksów, koncentratów i mieszanek paszowych

Z próbki do badań sporządzić, z dokładnością do 0,01 g, odważkę próbki analitycznej 10 g i umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml. Dodać 100 ml alkoholu metylowego (3.4) i zawartość kolby wstrząsać przez 30 min na wstrząsarce laboratoryjnej. Ekstrakt przesączyć i rozcieńczyć alkoholem metylowym (3.4) do stężenia 10 µg/ml. Następnie oczyścić na kolumnie chromatograficznej z tritlenkiem diglinu (3.9). Do kolumny szklanej wprowadzić niewielki kawałek waty oraz warstwę trójtlenku diglinu grubości około 6 cm. Na tak przygotowaną kolumnę wprowadzić rozcieńczony przesącz. Zebrać 50 ml filtratu, odlewając kilka pierwszych mililitrów roztworu. Do kolby pomiarowej o pojemności 50 ml przenieść 10 ml filtratu, następnie dodać 10 ml alkoholu metylowego (3.2) i uzupełnić do kreski alkoholem metylowym (3.3). Stężenie otrzymanego ekstraktu wynosi 2,0 g/ml.

7.1.3. Przygotowanie roztworów ekstraktów do badań

Z roztworu o stężeniu 2,0 µg/ml (U₄) za pomocą alkoholu metylowego (3.3) przygotować roztwory o stężeniach 1,0 µg/ml (U₃), 0,5 µg/ml (U₂) oraz 0,25 µg/ml (U₁) metodą kolejnych rozcieńczeń w stosunku 1 + 1.

7.2. Przygotowanie płytek do oznaczeń i przeprowadzenie badania

Dla każdej próbki należy przygotować cztery płytki. Upłynnić uprzednio przygotowaną według (5.2) pożywkę agarową, ostudzić do temperatury 50°C i wprowadzić optymalną określoną według (5.5) ilość zawiesiny zarodników Bacillus subtilis ATCC 6633, przygotowaną według (5.4). Ustawić płytki Petriego na wypoziomowanym stole i rozlać po 18 ml zaszczepionej pożywki. Po zastygnięciu agaru na każdej płytce wyciąć za pomocą korkoboru po 8 studzienek. Studzienki powinny się znajdować w jednakowej odległości jedna od drugiej z jednoczesnym zachowaniem odstępu około 1,5 cm od brzegu płytki. Do studzienek wlewać po 0,15 ml roztworu wzorcowego roboczego narazyny o odpowiednim stężeniu S₄, S₃, S₂, S₁, przygotowanego według (6.2), oraz roztworu ekstraktów do badań w ilości 0,15 ml (U₄, U₃, U₂, U₁), przygotowanych według (7.1.3), w następujący sposób. Do pierwszej studzienki, zaznaczonej na obwodzie płytki dermatografem wprowadzić roztwór wzorcowy o stężeniu 2,0 µg/ml (S₄), a następnie do kolejnych studzienek, posuwając się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, roztwory wzorcowe o stężeniach: 1,0 µg/ml (S₃); 0,5 µg/ml (S₂) i 0,25 µg/ml (S₁) i roztwory ekstraktów do badań o stężeniach 2,0 µg/ml (U₄); 1,0 µg/ml (U₃); 0,5 µg/ml (U₂) i 0,25 µg/ml (U₁). Płytki pozostawić przez 1 h na stole laboratoryjnym w temperaturze pokojowej, następnie wstawić je do cieplarki i inkubować od 16 h do 18 h w temperaturze 30°C.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

Po okresie inkubacji zmierzyć średnice stref zahamowania wzrostu szczepu testowego przyrządem do pomiaru stref lub suwmiarką z dokładnością do 0,1 mm. Wyniki pomiarów zapisać w tablicy i wyliczyć średnie arytmetyczne wyników pomiarów dla odpowiadających sobie stężeń i stref z czterech płytek, zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i badanego. Uzyskane średnie wyniki są podstawą do wyliczenia uśrednionej wartości wielkości stref zahamowania wzrostu dla najniższego SL i najwyższego SH stężenia wzorca oraz próbki U według wzorów:

    7 S₁ + 4 S₂ + S₄ - 2 S₈

SL = -----------------------                           (1),

             10

    7 S₈ + 4 S₄ + S₂ - 2 S₁

SH = -----------------------                           (2),

             10

w których:

S₁, S₂, S₃, S₄ - średnie arytmetyczne średnic stref zahamowania wzrostu w przypadku kolejnych stężeń wzorca narazyny według (6.2).

W celu obliczenia wielkości stref zahamowania wzrostu bakterii w próbce należy wykorzystać te same wzory, wstawiając zamiast symbolu S symbol U.

Wyliczyć różnice SH - SL i UH - UL.

Jeżeli wyliczone różnice nie są większe niż 10% ich średniej wartości, należy uznać, że został spełniony warunek równoległości obrazujący zależność między stężeniem narazyny a wielkością stref zahamowania wzrostu bakterii odpowiednio dla roztworów wzorcowych, jak i badanych. Mając zebrane w tablicach średnie wartości stref zahamowania wzrostu bakterii dla poszczególnych stężeń wzorca i próbki, należy obliczyć logarytm A według wzoru:

       (U₁ + U₂ + U₄ + U₈ - S₁ - S₂ - S₄ - S₈) x 0,6021

log A = ------------------------------------------------                  (3)

           U₄ + U₈ + S₄ + S₈ - U₁ - U₂ - S₁ - S₂

Zawartość narazyny (X) w badanej próbce, w jednostkach takich, jakie zostały przyjęte dla zawartości założonej w badanej próbie, obliczyć według wzoru:

X = B * A                         (4),

w którym:

B -   założona zawartość narazyny w badanym produkcie, np. w ml/kg,

A -   współczynnik proporcjonalności odczytany z logarytmu A.

Jeśli współczynnik proporcjonalności A znajduje się poza przedziałem 0,5 - 2,0, oznaczanie należy powtórzyć, wykonując nowe rozcieńczenia ekstraktu próby w celu zbliżenia stężeń zawartej narazyny do stężeń we wzorcach roboczych. Jeżeli to niemożliwe, należy zbliżyć stężenia roztworów wzorcowych do badanych.

9. WYNIK KOŃCOWY

Za wynik końcowy należy przyjąć średnią arytmetyczną dwóch równoległych oznaczeń różniących się nie więcej niż:

-   5% wartości błędu względnego w przypadku preparatu handlowego i premiksu,

-   10% wartości błędu względnego w przypadku koncentratu i mieszanki paszowej.

7.16. OZNACZANIE KLOPIDOLU

(3,5-dichloro-2,6-dimetylo-4-pirydynol)

1. CEL I ZAKRES

Spektrofotometryczna metoda służy do oznaczania zawartości klopidolu w premiksach, preparatach handlowych, koncentratach i mieszankach paszowych.

2. ZASADA METODY

Metoda polega na ekstrakcji klopidolu za pomocą mieszaniny: alkohol metylowy - amoniak, oczyszczeniu ekstraktu na kolumnie z tlenkiem glinu, wyizolowaniu klopidolu z ekstraktu za pomocą żywicy jonowymiennej, eluowaniu klopidolu z żywicy 40% kwasem octowym i pomiarze absorbancji uzyskanego roztworu w zakresie światła ultrafioletowego.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Podczas badań, jeżeli nie zaznaczono inaczej, należy stosować wyłącznie odczynniki cz.d.a. oraz wodę podwójnie destylowaną lub wodę o równoważnej czystości.

3.1. Kwas octowy, roztwór 40% (V/V)

3.2. Amoniak (woda amoniakalna)

3.3. Alkohol metylowy

3.4. Alkohol metylowy, roztwór 80% (V/V)

3.5. Alkohol metylowy, roztwór 40% (V/V)

3.6. Mieszanina ekstrakcyjna: alkohol metylowy - amoniak (95 + 5)

3.7. Tlenek glinu, obojętny, I stopień aktywności, do chromatografii kolumnowej

3.8. Żywica anionitowa, o rozdrobnieniu od 100 mesh do 200 mesh

3.9. Klopidol, wzorzec (3,5-dichloro-2,6-dimetylo-4-pirydynol)

4. APARATURA I SPRZĘT

Stosuje się następującą aparaturę i przyrządy:

4.1. Kolumny szklane do chromatografii ze spiekiem P-2, o średnicy wewnętrznej 20 mm i wysokości 250 mm

4.2. Spektrofotometr do pomiaru absorbancji w nadfiolecie

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie roztworów wzorcowych i sporządzanie krzywej wzorcowej

Odważyć, z dokładnością do 0,0001 g, taką ilość wzorca klopidolu (3.9), aby po rozpuszczeniu w mieszaninie: alkohol metylowy - amoniak otrzymać roztwór o stężeniu 0,1 mg/ml.

Do kolb pomiarowych o pojemności 100 ml odmierzyć po: 5 ml, 10 ml, 15 ml roztworu wzorcowego klopidolu i uzupełnić do kreski roztworem kwasu octowego (3.1). Zmierzyć absorbancję tych roztworów przy długości fali 267 nm, 297 nm i 327 nm, stosując roztwór kwasu octowego (3.1) jako odnośnik. Po skorygowaniu absorbancji według wzoru:

A_skorygowane = A₂₆₇ + A₃₂₇ - A₂₉₇

wykreślić krzywą wzorcowania, odkładając na osi rzędnych wartości absorbancji, a na osi odciętych stężenie klopidolu w poszczególnych roztworach, w mg/ml.

5.2. Przygotowanie próbki do badań

Z próbki laboratoryjnej przygotować próbkę do badań. Z próbki do badań odważyć, z dokładnością 0,001 g, taką ilość badanego preparatu, aby zawierała 50 mg klopidolu. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml, dodać 150 ml mieszaniny: alkohol metylowy - amoniak (3.6), zamknąć korkiem i wytrząsnąć przez 30 min na wstrząsarce laboratoryjnej. Następnie zawartość kolby przesączyć przez sączek, przemyć kilkakrotnie mieszaninę ekstrakcyjną (3.6) i uzupełnić do 250 ml w kolbie pomiarowej.

5.3. Wykonanie oznaczenia

Przygotować cztery kolumny (4.1). Do dwóch kolumn wsypać tlenek glinu (3.7) na wysokość 10 cm, przemyć mieszaniną ekstrakcyjną (3.6), a następnie alkoholem metylowym (3.3) do odczynu obojętnego.

Do następnych dwóch kolumn wprowadzić papkę żywicy anionitowej (3.8) w alkoholu metylowym (3.4) do uzyskania warstwy 5 cm i przemyć 100 ml alkoholu metylowego (3.4).

Na kolumny z tlenkiem glinu delikatnie nanieść: na jedną - taką ilość mililitrów klarownego ekstraktu, aby zawierała około l mg klopidolu, a na drugą - taką samą ilość mililitrów mieszaniny ekstrakcyjnej (3.6). Pod kolumnami z tlenkiem glinu ustawić kolumny z żywicą anionitową. Następnie kolumny z tlenkiem glinu przemyć trzykrotnie porcjami po 12 ml alkoholu metylowego (3.4), pozwalając, aby eluat wypływający z kolumny wypełnionej tlenkiem glinu spływał kroplami do kolumny wypełnionej żywicą anionitową.

Kolumny z tlenkiem glinu usunąć, a kolumny z żywicą anionitową przemyć czterokrotnie, porcjami po 15 ml alkoholu metylowego (3.4). Wszystkie wycieki usunąć.

Klopidol eluować powoli za pomocą kwasu octowego (3.1) porcjami po 5 ml. Eluat zbierać do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml. Uzupełnić do kreski roztworem do eluowania.

Zmierzyć absorbancje otrzymanych roztworów i obliczyć absorbancje skorygowane, tak jak dla roztworów wzorcowych (5.1). Następnie z krzywej wzorcowej odczytać stężenie klopidolu w mg/ml.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość klopidolu (X), w g/kg, w badanej próbce obliczyć według wzoru:

   a * 25.000

X ------------,

     m * V

w którym:

a -  stężenie klopidolu odczytane z krzywej wzorcowej, w mg/ml,

m -  odważka próbki, w g,

V -  objętość ekstraktu podanego na kolumnę, w ml,

25.000 - współczynnik przeliczeniowy

[ mg * 250ml * 100ml  ]

[-------------------- ]

[        ml           ]

[      ------         ]

[      g * ml         ]

7. WYNIK KOŃCOWY

Za wynik należy przyjąć średnią arytmetyczną wyników dwóch równoległych oznaczeń, różniących się nie więcej niż:

-   5% wartości błędu względnego w przypadku preparatów handlowych,

-   10% wartości błędu względnego w przypadku premiksów,

-   20% wartości błędu względnego w przypadku koncentratów i mieszanek paszowych.

7.17. OZNACZANIE MADURAMYCYNY (CYGRO)

1. CEL I ZAKRES

Metoda wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej HPLC służy do oznaczania zawartości maduramycyny (antybiotyk jonoforowy o właściwościach kokcydiostatycznych) w preparatach handlowych, premiksach i koncentratach.

2. ZASADA METODY

Zasada metody polega na ekstrakcji maduramycyny dichlorometanem w acetonitrylu, przeprowadzeniu w pochodną densylohydrazyny, oczyszczeniu na kolumience z Florsilem i oznaczeniu techniką wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej z detekcją fluorymetryczną.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Podczas badań, jeżeli nie zaznaczono inaczej, należy stosować wyłącznie odczynniki cz.d.a. oraz wodę podwójnie destylowaną lub wodę o równoważnej czystości.

3.1. Acetonitryl czystości HPLC

3.2. Dichlorometan czystości HPLC

3.3. Densylohydrazyna (1-dimetyloaminonaftaleno-5-sulfonylohydrazyna), roztwór 0,75% (m/m) w acetonitrylu. Odważyć 0,75 g substancji i rozpuścić w acetonitrylu w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml. Przechowywać w lodówce. Trwałość roztworu jeden tydzień.

3.4. Kwas trichlorooctowy, roztwór 15% (m/m) w acetonitrylu. Należy odważyć 15 g substancji i rozpuścić w acetonitrylu w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml. Przechowywać w lodówce. Trwałość roztworu jeden tydzień.

3.5. Roztwór do eluowania, acetonitryl, roztwór 90% (m/m) w wodzie

3.6. Wzorzec - maduramycyna potasu CL 274,297

3.7. Sito molekularne typ 3A

3.8. Faza ruchoma do wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej. Odważyć 0,25 g hydrosiarczanu tetrabutyloamonu (TBAS), rozpuścić w 180 ml wody w kolbie pomiarowej o pojemności 1l i uzupełnić zawartość do kreski acetonitrylem.

4. APARATURA I SPRZĘT

Stosuje się następującą aparaturę i sprzęt:

4.1. Waga analityczna

4.2. Wstrząsarka laboratoryjna

4.3. Wysokociśnieniowy chromatograf cieczowy z detekcją fluorymetryczną

4.4. Kolumna chromatograficzna - Hypersil ODS 250 x 4,9 lub odpowiednia

4.5. Kolumienki z Florsilem

4.6. Naczynka reakcyjne o pojemności 5 ml zamykane korkiem teflonowym

5. PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW WZORCA

5.1. Podstawowy roztwór wzorcowy

Odważyć, z dokładnością do 0,0001 g, taką ilość wzorca (3.6), aby po rozpuszczeniu w acetonitrylu otrzymać roztwór o stężeniu 1 mg/ml. Z roztworu tego pobrać 5 ml do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml i uzupełnić acetonitrylem do kreski; stężenie tak przygotowanego roztworu wynosi 50 µg/ml. Trwałość roztworu jeden miesiąc.

5.2. Robocze roztwory wzorcowe

Do trzech kolb pomiarowych o pojemności 25 ml należy pobrać po 1,5 ml, 2 ml i 2,5 ml z roztworu wzorca o stężeniu 50 µg/ml, dodać 5 ml dichlorometanu i uzupełnić acetonitrylem do kreski. Robocze roztwory o stężeniu: 3 µl/ml, 4 µl/ml i 5 µl/ml. Roztwory robocze należy przygotować w dniu wykonania oznaczenia.

6. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

6.1. Przygotowanie ekstraktów analizowanych próbek

Odważyć, z dokładnością 0,001 g, 0,1 g preparatu handlowego 1%; od 1 g do 2 g premiksu i 25 g koncentratu. Odważkę umieścić w kolbie stożkowej o pojemności 500 ml, dodać 50 ml dichlorometanu, zamknąć korkiem i wstrząsać przez 30 min na wstrząsarce laboratoryjnej. Następnie dodać 200 ml acetonitrylu, 15 g sita molekularnego typu 3A i wstrząsać przez dalsze 30 min. Zawartość kolby pozostawić na 10 min do odstania, a następnie zdekantować około 10 ml ekstraktu.

6.2. Otrzymywanie pochodnych i ich oczyszczenie

Do naczynka reakcyjnego o pojemności 5 ml należy wprowadzić po 0,6 ml roztworu densylohydrazyny (3.3), 0,6 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (3.4) i 2 ml ekstraktu; zakryć naczynko korkiem, całość wstrząsać przez 10 s. Zawartość naczynka dokładnie przenieść do pozbawionej tłoka strzykawki wcześniej połączonej z kolumienką z Florsilem, odczekać, aż ekstrakt grawitacyjnie przesączy się, a następnie pięciokrotnie przemyć kolumienkę acetonitrylem, stosując porcje po 3 ml. Za pomocą tłoka strzykawki usunąć resztę cieczy z kolumny, wtłaczając do niej powietrze, i wyciek odrzucić. Następnie usunąć tłok strzykawki i wyeluować maduramycynę z kolumienki 90% acetonitrylem, zbierając wyciek do kolby pomiarowej o pojemności 5 ml. Zawartość kolby uzupełnić do kreski roztworem do eluowania. Identyczną procedurę zastosować do roboczych roztworów wzorca.

6.3. Warunki pracy chromatografu

Warunki pracy chromatografu:

-   temperatura pracy: pokojowa,

-   detekcja fluorymetryczna: wzbudzenie 220 nm, emisja 470 nm,

-   przepływ fazy ruchomej (3.8): 3.000 µl/min,

-   objętość dozowania: 20 µl.

Kolumnę chromatograficzną należy przemyć fazą ruchomą (3.8) aż do uzyskania stabilnej linii podstawowej na rejestratorze.

Następnie podać na kolumnę przygotowane roztwory wzorcowe o stężeniu 3 µg/ml, 4 µg/ml i 5 µg/ml i roztwór próbki badanej (6.2) i zarejestrować chromatogramy. Czas retencji piku właściwego wynosi około 12 min.

7. OBLICZANIE WYNIKÓW

Jeżeli wysokości pików poszczególnych roztworów wzorcowych zachowują liniowość, to zawartość maduramycyny (x), w mg/kg, w badanej próbce należy obliczyć według wzoru:

    H_p * C_w * 250

x = ---------------,

       H_w * m

w którym:

H_p -  wysokość piku maduramycyny na chromatografie roztworu próbki badanej, w ml,

H_w -  wysokość piku maduramycyny na chromatografie roztworu wzorcowego zbliżonego do Hp, w milimetrach,

C_w -  stężenie maduramycyny w roztworze wzorcowym, w µg/ml,

m -   odważka próbki badanej, w g.

8. WYNIK KOŃCOWY

Za wynik należy przyjąć średnią arytmetyczną wyników dwóch równoległych oznaczeń, różniących się nie więcej niż:

-   20% wartości względnej w stosunku do wyższego wyniku dla zawartości od 50 mg/kg do 1.000 mg/kg,

-   10% wartości względnej w stosunku do wyższego wyniku dla zawartości powyżej 1.000 mg/kg.

Rozdział 8

BADANIE SUBSTANCJI I MATERIAŁÓW NIEPOŻĄDANYCH I SZKODLIWYCH

8.1. OZNACZANIE AFLATOKSYNY B₁ METODĄ JEDNOKIERUNKOWEJ CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości aflatoksyny B₁ w paszach jednoskładnikowych. Metody nie można stosować w obecności pulpy cytrusowej. Granica oznaczalności metody wynosi 0,01 mg/kg (10 ppb). W obecności substancji interferujących konieczne jest powtórzenie oznaczania metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC.

2. ZASADA METODY

Próbka jest poddawana ekstrakcji chloroformem. Ekstrakt jest sączony, a jego część poddawana oczyszczaniu metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Eluat jest odparowywany, a pozostałość rozpuszczana ponownie w ściśle określonej objętości chloroformu lub mieszaniny benzenu i acetonitrylu. Część tego roztworu jest poddawana chromatografii cienkowarstwowej (TLC). Zawartość aflatoksyny B₁ jest oznaczana poprzez naświetlanie chromatogramu lampą UV, wizualnie lub fluorodensytometrycznie, przez porównanie ze znaną ilością substancji wzorcowej aflatoksyny B₁. Identyfikacja aflatoksyny B₁ wyekstrahowanej z paszy powinna być potwierdzona poprzez postępowanie identyfikacyjne.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Wszystkie odczynniki powinny mieć jakość "czysty do analizy", jeżeli nie zaznaczono inaczej.

3.1. Aceton

3.2. Chloroform, stabilizowany dodatkiem alkoholu etylowego 96% w ilości od 0,5 do 1,0% (V/V)

3.3. N-heksan

3.4. Metanol

3.5. Eter dietylowy bezwodny, wolny od nadtlenków

3.6. Mieszanina benzenu i acetonitrylu: 98/2 (V/V)

3.7. Mieszanina chloroformu (3.2) i metanolu (3.4): 97/3 (V/V)

3.8. Żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej, średnica cząstek od 0,05 do 0,20 mm

3.9. Wata bawełniana odtłuszczona chloroformem lub wata szklana

3.10. Siarczan sodu bezwodny, granulowany

3.11. Gaz obojętny, np. azot

3.12. Kwas chlorowodorowy, 1 mol/l (1 N)

3.13. Kwas siarkowy 50% (V/V)

3.14. Ziemia okrzemkowa (hyflosupelsel), przemywana kwasem

3.15. Żel krzemionkowy G-HR lub podobny, do TLC

3.16. Wzorcowy roztwór zawierający około 0,1 µg aflatoksyny B₁ w mililitrze chloroformu (3.2) lub mieszaniny benzen / acetonitryl (3.6), przygotowany i sprawdzony jak podano w (7).

3.17. Roztwór wzorcowy do testów identyfikacyjnych zawierający około 0,1 µg aflatoksyny B₁ i B₂ w mililitrze chloroformu (3.2) lub mieszaniny benzen / acetonitryl (3.6). Stężenia aflatoksyn podano przykładowo. Stężenia te muszą być tak dobrane, aby otrzymać taką samą intensywność fluorescencji dla obu aflatoksyn.

3.18. Rozpuszczalniki rozwijające:

3.18.1. Chloroform (3.2) / aceton (3.1): 9/1 (V/V), komora nienasycona

3.18.2. Eter dietylowy (3.5) / metanol (3.4) / woda: 96/3/1 (V/V/V), komora nienasycona

3.18.3. Eter dietylowy (3.5) / metanol (3.4) / woda: 94/4,5/1,5 (V/V/V), komora nasycona

3.18.4. Chloroform (3.2) / metanol (3.4): 94/6 (V/V), komora nasycona

3.18.5. Chloroform (3.2) / metanol (3.4): 97/3 (V/V), komora nasycona

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Rozdrabniacz

4.2. Wstrząsarka lub mieszadło magnetyczne

4.3. Karbowany sączek papierowy Schleicher i Schull Nr 588 lub podobny, średnica 24 cm

4.4. Kolumna szklana do chromatografii (średnica wewnętrzna: 22 mm, długość: 300 mm), z kurkiem PTFE i zbiornikiem o pojemności 250 ml

4.5. Odparowywacz próżniowy obrotowy z kolbą okrągłodenną o pojemności 500 ml

4.6. Kolba stożkowa o pojemności 500 ml, z korkiem szklanym

4.7. Zestaw do chromatografii cienkowarstwowej

4.8. Płytki szklane do chromatografii cienkowarstwowej, 200 x 200 mm, przygotowane w sposób następujący (ilość żelu wystarczająca do pokrycia pięciu płytek). Umieścić 30 g żelu krzemionkowego G-HR (3.15) w kolbie stożkowej. Dodać 60 ml wody, zamknąć korkiem i wstrząsać w czasie jednej minuty. Nanieść mieszaninę na płytki tak, aby uzyskać jednolitą warstwę grubości 0,25 mm. Pozostawić na powietrzu do wyschnięcia, a następnie przechowywać w eksykatorze zawierającym żel krzemionkowy. Z chwilą użycia aktywować płytki przez wstawienie do suszarki o temperaturze 110°C na jedną godzinę.

Płytki nadają się do użycia, jeżeli dają wyniki podobne do tych uzyskanych wcześniej, na płytkach przygotowanych jak powyżej.

4.9. Lampa UV o długiej fali (360 nm). Intensywność promieniowania lampy powinna umożliwić, z odległości 10 cm, rozróżnienie plamki zawierającej 1 ng aflatoksyny B₁ nałożonej na płytkę TLC.

4.10. Probówka skalowana o pojemności 10 ml, z polietylenowymi korkami

4.11. Spektrofotometr UV

4.12. Fluorodenzytometr (do wyboru)

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby w całości przechodziła przez sito o wymiarach oczka 1 mm.

5.2. Ekstrakcja

Umieścić 50 g rozdrobnionej, homogennej próbki w 500 ml kolbie stożkowej (4.6). Dodać 25 g ziemi okrzemkowej (3.14), 25 ml wody i 250 ml chloroformu (3.2). Zamknąć kolbę, wstrząsać lub mieszać przez 30 minut na urządzeniu (4.2) i przesączyć przez karbowany sączek (4.3). Odrzucić pierwsze 10 ml przesączu, a następnie zebrać 50 ml.

5.3. Oczyszczanie na kolumnie

Umieścić w dolnym końcu szklanej kolumny chromatograficznej (4.4) zwitek bawełnianej lub szklanej waty (3.9), napełnić dwie trzecie rurki chloroformem (3.2) i dodać 5 g siarczanu sodu (3.10).

Sprawdzić, czy górna powierzchnia siarczanu sodowego jest płaska, następnie dodawać małymi porcjami 10 g żelu krzemionkowego (3.8). Lekko wstrząsnąć po każdym dodatku w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Pozostawić na 15 minut, a następnie ostrożnie dodać 15 g siarczanu sodowego (3.10). Pozwolić, aby poziom cieczy obniżył się do chwili, aż znajdzie się tuż nad warstwą siarczanu sodu.

Zmieszać 50 ml ekstraktu zebranego według (5.2) z 100 ml n-heksanu (3.3) i przenieść ilościowo mieszaninę na kolumnę. Pozwolić, aby poziom cieczy obniżył się do chwili, aż znajdzie się nad warstwą siarczanu sodu. Wyciek z kolumny odrzucić. Następnie dodać 100 ml eteru dietylowego (3.5) i znowu pozwolić, aby poziom cieczy obniżył się do chwili, aż znajdzie się nad warstwą siarczanu sodu. W czasie tych czynności należy uważać, aby szybkość przepływu wynosiła od 8 do 12 ml na minutę i aby wypełnienie kolumny nie pozostawało suche. Odrzucić wyciek. Eluować kolumnę przy użyciu 150 ml mieszaniny chloroform / metanol (3.7) i zebrać cały eluat.

Odparować eluat prawie do sucha w temperaturze nie wyższej niż 50°C w strumieniu obojętnego gazu (3.11) na odparowywaczu obrotowym (4.5). Przenieść ilościowo pozostałość, przy użyciu chloroformu (3.2) lub mieszaniny benzen / acetonitryl (3.6), do skalowanej probówki o pojemności 10 ml (4.10). Zatężyć roztwór przez odparowanie rozpuszczalnika w strumieniu obojętnego gazu (3.11), a następnie dopełnić do 2 ml chloroformem (3.2) lub mieszaniną benzen / acetonitryl (3.6).

5.4. Chromatografia cienkowarstwowa

Nanieść na płytkę TLC (4.8), 2 cm od dolnego brzegu w odstępach co 2 cm, wskazane poniżej objętości roztworu wzorcowego i ekstraktu:

-   10, 15, 20, 30 i 40 µl roztworu wzorcowego aflatoksyny B1 (3.16);

-   10 µl ekstraktu otrzymanego i nałożonego według (5.3), 20 µl roztworu wzorcowego (3.16);

-   10 i 20 µl ekstraktu otrzymanego według (5.3).

Rozwinąć chromatogram w ciemności, stosując jeden z rozpuszczalników rozwijających (3.18). Wybór rozpuszczalnika powinien być dokonany wstępnie, po nałożeniu 25 µl roztworu wzorcowego do testów identyfikacyjnych (3.17) na płytkę i sprawdzeniu, że aflatoksyny B₁ i B₂ są zupełnie rozdzielone.

Pozwolić, aby rozpuszczalnik odparował z płytki w ciemności, a następnie naświetlić światłem UV, umieszczając płytkę 10 cm od źródła światła (4.9). Plamki aflatoksyny B₁ charakteryzują się niebieską fluorescencją.

5.5. Oznaczanie ilościowe

Oznaczyć zawartość wizualnie lub przy użyciu fluorodenzytometru, jak wskazano poniżej.

5.5.1. Pomiar wizualny

Oznaczyć ilość aflatoksyny B₁ w ekstrakcie przez dobranie intensywności fluorescencji plamek ekstraktu z intensywnością fluorescencji plamki roztworu wzorcowego. Interpolować w przypadku konieczności. Fluorescencja otrzymana przez nałożenie ekstraktu na roztwór wzorcowy powinna być bardziej intensywna niż fluorescencja 10 µl ekstraktu. Nie może być widoczna więcej niż jedna plamka. Jeżeli intensywność fluorescencji 10 µl ekstraktu jest większa niż 40 µl roztworu wzorcowego, rozcieńczyć ekstrakt od 10 do 100 razy chloroformem (3.2) lub mieszaniną benzen / acetonitryl (3.6) przed poddaniem go chromatografii cienkowarstwowej.

5.5.2. Pomiar fluorodenzytometryczny

Zmierzyć intensywność fluorescencji plamki aflatoksyny B₁ w fluorodenzytometrze (4.12), przy wzbudzeniu 365 nm i emisji 443 nm. Oznaczyć ilość aflatoksyny B₁ w ekstrakcie przez porównanie intensywności fluorescencji plamek z intensywnością plamek wzorca aflatoksyny B₁.

5.6. Potwierdzenie identyczności aflatoksyny B₁

Potwierdzić identyczność aflatoksyny B₁ w ekstrakcie w sposób przedstawiony poniżej.

5.6.1. Próba z kwasem siarkowym

Spryskać kwasem siarkowym (3.13) chromatogram otrzymany według (5.4). Fluorescencja plamek aflatoksyny B₁ powinna zmienić się z niebieskiej na żółtą pod lampą UV.

5.6.2. Dwukierunkowa chromatografia powodująca tworzenie hemiacetalu aflatoksyny B₁.

Czynności opisane poniżej muszą być przeprowadzone ściśle według diagramu na rys. 8.

5.6.2.1. Nanoszenie roztworów

Wyciąć dwie proste linie na płytce (4.8) równolegle do dwóch przyległych boków (6 cm od każdego z nich) w celu ograniczenia migracji czoła rozpuszczalnika. Nałożyć następujące roztwory na płytkę, stosując kapilarne pipety lub mikrostrzykawki:

-   w punkcie A: oczyszczony ekstrakt próbki otrzymany według (5.3), zawierający około 2,5 µg aflatoksyny B₁

-   w punkcie B i C: 25 µl wzorcowego roztworu (3.16).

5.6.2.2. Rozwinięcie

Rozwijać chromatogram w kierunku I w ciemności, wykorzystując rozpuszczalnik (3.18.1) (l cm warstwa w nienasyconej komorze) do chwili, gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie limitującą linię. Wyjąć płytki z komory i pozostawić w celu wyschnięcia w ciemności, w temperaturze pokojowej, przez pięć minut. Następnie spryskać kwasem chlorowodorowym (3.12) pas do wysokości 2,5 cm, pokrywający punkty A i B (zakreskowane pole na rys. 8), aż do ściemnienia, zabezpieczając pozostałą część płytki szklaną szybką. Pozostawić na 10 minut w ciemności i wysuszyć w strumieniu powietrza w temperaturze otoczenia. Następnie rozwinąć chromatogram w kierunku II w ciemności, stosując rozpuszczalnik rozwijający (3.18.1) (1 cm warstwa rozpuszczalnika w nienasyconej komorze) do czasu, gdy czoło rozpuszczalnika osiągnie linię ograniczającą. Wyjąć płytkę z komory i wysuszyć w temperaturze pokojowej.

5.6.2.3. Interpretacja chromatogramu

Zbadać chromatogram pod lampą UV i zaznaczyć następujące cechy:

(a)  Pojawienie się niebieskiej fluorescencji plamki aflatoksyny B₁, pochodzącej od roztworu wzorcowego nałożonego w punkcie C (migracja w kierunku I).

(b)  Pojawienie się niebieskiej fluorescencji plamki nieprzereagowanej (z kwasem chlorowodorowym) aflatoksyny B₁ i intensywniejszej, niebieskiej fluorecsencji plamki hemiacetalu aflatoksyny B₁, pochodzących z roztworu wzorcowego nałożonego w punkcie B (migracja w kierunku II).

(c)  Pojawienie się plamek porównywalnych z opisanymi w punkcie (b), pochodzących z ekstraktu próbki nałożonego w punkcie A. Położenie tych plamek zależy przede wszystkim od długości drogi migracji aflatoksyny B₁ z punktu A w kierunku I (takiej samej, jaką przebył wzorzec nałożony w punkcie C), a następnie od drogi migracji z tego punktu w kierunku II hemiacetalu aflatoksyny B₁ (takiej samej, jaką przebył wzorzec nałożony w punkcie B). Intensywność fluorescencji plamki hemiacetalu pochodzących z ekstraktu i wzorca nałożonego w punkcie B powinna być większa.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

6.1. Z pomiarów wizualnych

Zawartość aflatoksyny B₁ w µg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

S * Y * V

-----------,

  W * X

w którym:

Y i X  stanowią odpowiednio objętości w µl roztworu wzorcowego aflatoksyny B₁ (3.16) i ekstraktu charakteryzujących się podobną intensywnością fluorescencji;

S -   stężenie aflatoksyny B₁, w µg/ml, w roztworze wzorcowym (3.16);

V -   końcowa objętość ekstraktu, w mikrolitrach, uwzględniając wszystkie konieczne rozcieńczenia;

W -   masa próbki, w g, odpowiadająca objętości ekstraktu pobranego celem oczyszczenia na kolumnie;

6.2. Z pomiarów fluorodenzytometrycznych

Zawartość aflatoksyny B₁ w µg/kg, w próbce obliczyć według wzoru:

S * V

-------,

W * Y

w którym:

Y -   objętość, w µl, ekstraktu naniesionego na płytkę (10 lub 20 µl);

S -   ilość, w ng, aflatoksyny B₁ w ekstrakcie naniesionym na płytkę (proporcjonalna do objętości ekstraktu Y), obliczona na podstawie pomiarów;

V -   końcowa objętość ekstraktu w mikrolitrach, uwzględniając wszystkie konieczne rozcieńczenia;

W -   masa próbki, w g, odpowiadająca objętości ekstraktu pobranego celem oczyszczenia na kolumnie.

7. PRZYGOTOWANIE I SPRAWDZANIE ROZTWORU WZORCOWEGO (3.16)

7.1. Oznaczanie stężenia aflatoksyny B₁

Przygotować wzorcowy roztwór aflatoksyny B₁ w chloroformie (3.2) lub w mieszaninie benzen / acetonitryl (3.6) o stężeniu od 8 do 10 µg/ml. Określić spektrum absorbancji w zakresie od 330 do 370 nm przy użyciu spektrofotometru (4.11).

Zmierzyć gęstość optyczną (A) przy 363 nm w przypadku roztworu chloroformowego lub przy 348 nm w przypadku roztworu uzyskanego po zmieszaniu benzenu z acetonitrylem.

Obliczyć stężenie w µg aflatoksyny B₁ na ml roztworu według podanych niżej wzorów:

312 * A * 1.000

-----------------                 dla roztworu chloroformowego,

   20.600

312 * A * 1.000

-----------------                 dla roztworu benzen / acetonitryl.

   19.800

Odpowiednio rozcieńczyć, chroniąc przed światłem dziennym, w celu otrzymania roboczego roztworu wzorcowego o zawartości aflatoksyny B₁ około 0,1 µg/ml. Roztwór ten, przechowywany w lodówce przy temperaturze 4°C, zachowuje stabilność przez dwa tygodnie.

7.2. Badanie czystości chromatograficznej

Nanieść na płytkę (4.8) 5 µl roztworu wzorcowego aflatoksyny B₁ o stężeniu od 8 do 10 µg/ml (7.1). Rozwinąć chromatogram, jak pokazano w (5.4). W świetle UV chromatogram powinien wykazywać tylko jedną plamkę, a w miejscu nałożenia roztworu wzorcowego nie powinny być widoczne ślady fluorescencji.

8. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych z tej samej próbki przez tego samego analityka nie może być wyższa niż:

-   25% wartości w stosunku do najwyższego wyniku dla zawartości aflatoksyny B₁ od 10 do 20 µg/kg;

-   5 µg wartości bezwzględnej dla zawartości od 20 do 50 µg/kg;

-   10% wartości w stosunku do najwyższego wyniku dla zawartości powyżej 50 µg/kg.

9. OBJAŚNIENIA

9.1. Odtłuszczanie próbki zawierającej powyżej 5% tłuszczu powinno być prowadzone przy użyciu eteru naftowego (temperatura wrzenia od 40 do 60°C) po przygotowaniu według (5.1). W takich przypadkach wyniki analizy powinny być podane w przeliczeniu na nieodtłuszczoną próbkę.

9.2. Odtwarzalność wyników metody, tj. zmienność pomiędzy wynikami badania tej samej próbki uzyskanymi przez dwa lub więcej laboratoriów, powinna wynosić:

-   50% średniej wartości dla zawartości aflatoksyny B₁ od 10 do 20 µg/kg;

-   10 µg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości powyżej 20 µg/kg aż do 50 µg/kg;

-   20% średniej wartości dla zawartości powyżej 50 µg/kg.

grafika

rys. 6 - górny

rys. 7 - dolny

grafika

rys. 8

8.2. OZNACZANIE AFLATOKSYNY B₁ METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości aflatoksyny B₁ w paszach, łącznie z paszami zawierającymi pulpę cytrusową. Granica oznaczalności metody wynosi 0,001 mg/kg (1 ppb).

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowana chloroformem, ekstrakt sączony, a jego część jest oczyszczana na mikrokolumnach wypełnionych fazą Florisil i C₁₈. Końcowy rozdział i oznaczanie jest prowadzone przy zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na kolumnie wypełnionej fazą C₁₈, po której następuje derywatyzacja pokolumnowa przy użyciu wody jodowej i fluorometryczny pomiar.

Mikotoksyny są niezwykle toksycznymi substancjami. Czynności z ich użyciem powinny być wykonywane pod digestorium. Szczególne środki ostrożności powinny być podjęte przy czynnościach z toksynami w suchej postaci, ze względu na ich elektrostatyczne właściwości i tendencję do rozprzestrzeniania się w środowisku pracy.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Chloroform stabilizowany alkoholem etylowym w ilości od 0,5 do 1,0% wagowego (8.1)

3.2. Metanol, do HPLC, do przygotowania roztworu (3.6)

3.3. Aceton

3.4. Acetonitryl, do HPLC

3.5. Rozpuszczalniki eluujące: przygotować na dzień przed użyciem lub usunąć powietrze z rozpuszczalnika przy użyciu ultradźwięków.

3.5.1. Mieszanina acetonu (3.3) i wody, 98 + 2 (V + V)

3.5.2. Mieszanina wody i metanolu (3.2), 80 + 20 (V + V)

3.5.3. Mieszanina wody i acetonu (3.3), 85 + 15 (V + V)

3.6. Faza ruchoma do HPLC

Mieszanina wody, metanolu (3.2) i acetonitrylu (3.4), 130 + 70 + 40 (V + V + V)

Skład fazy ruchomej może wymagać dostosowania, zależnie od charakterystyki użytej kolumny HPLC.

3.7. Nasycony roztwór jodu: dodać 2 g jodu do 400 ml wody. Mieszać co najmniej przez 90 minut i przesączyć przez sączek membranowy (4.15). Chronić nasycony roztwór przed światłem w celu zapobiegnięcia fotodegradacji.

3.8. Celit 545 lub podobny, przemywany kwasem

3.9. Mikrokolumna z wypełnieniem Florisil (Waters SEP-PAK) lub podobna

3.10. Mikrokolumna wypełniona fazą C₁₈ (Waters SEP-PAK) lub podobna

3.11. Gaz obojętny, np. azot

3.12. Roztwór wzorcowy aflatoksyny B₁ w chloroformie, stężenie 10 µg/ml. Sprawdzić stężenie roztworu w sposób następujący: wykreślić spektrum absorpcji roztworu pomiędzy 330 i 370 nm przy użyciu spektrofotometru (4.23). Zmierzyć absorbancję w maksimum przy 363 nm. Obliczyć stężenie aflatoksyny B₁ w µg/ml roztworu według wzoru:

                   312 * A * 1.000

Stężenie (µg/ml) = ----------------- = 13,991 * A

                       22.300

3.12.1. Roztwór podstawowy aflatoksyny B₁ w chloroformie

Przenieść ilościowo 2,5 ml roztworu wzorcowego aflatoksyny B₁ (3.12) do kolby miarowej o pojemności 50 ml i dopełnić do kreski chloroformem (3.1). Przechowywać w chłodnym miejscu (temperatura 4°C) w ciemności, pod szczelnym zamknięciem, zawiniętą w folię.

3.13. Aflatoksyna B₁, roztwory kalibracyjne do HPLC

Do przygotowania tych roztworów stosować sprzęt szklany myty kwasem (4).

3.13.1. Roztwór kalibracyjny 4 ng/ml

Pozwolić kolbie objętościowej w aluminiowej folii zawierającej podstawowy roztwór wzorcowy (3.12.1) osiągnąć temperaturę pokojową (kilka godzin). Przenieść 400 µl podstawowego roztworu wzorcowego (200 ng aflatoksyny B₁) do kolby objętościowej o pojemności 50 ml i odparować do sucha w strumieniu gazu obojętnego (3.11). Rozpuścić pozostałość w około 20 ml mieszaniny woda / aceton (3.5.3), dopełnić do kreski mieszaniną woda / aceton i dobrze wymieszać.

3.13.2. Roztwór kalibracyjny 3 ng/ml

Przenieść ilościowo 7,5 ml roztworu kalibracyjnego (3.13.1) do kolby miarowej o pojemności 10 ml, dopełnić do kreski mieszaniną woda / aceton (3.5.3) i dobrze wymieszać.

3.13.3. Roztwór kalibracyjny 2 ng/ml

Przenieść ilościowo 25 ml roztworu kalibracyjnego (3.13.1) do kolby miarowej o pojemności 50 ml, dopełnić do kreski mieszaniną woda / aceton (3.5.3) i dobrze wymieszać.

Ten roztwór jest także wzorcem odniesienia, stosowanym do wielokrotnych wstrzyknięć podczas HPLC (5.5).

3.13.4. Roztwór kalibracyjny 1 ng/ml

Przenieść ilościowo 2,5 ml roztworu kalibracyjnego (3.13.1) do kolby miarowej o pojemności 10 ml, dopełnić do kreski mieszaniną woda / aceton (3.5.3) i dobrze zamieszać.

3.14. Ampułki zawierające mieszaninę aflatoksyn B₁, B₂, G₁ i G₂ o stężeniach odpowiednio 1, 0,5, 1 i 0,5 µg/ml, w 1 ml chloroformu

3.14.1. Roztwór testowy do chromatografii

Przenieść zawartość ampułki (3.14) do probówki zamykanej szklanym korkiem lub do naczyńka z nakrętką. Następnie przenieść 40 µl tego roztworu do probówki zamykanej szklanym korkiem (płukanej kwasem) (4.22). Odparować chloroform w strumieniu obojętnego gazu (3.11) i powtórnie rozpuścić w 10 ml mieszaniny woda / aceton (3.5.3).

3.15. Odczynniki do testu potwierdzającego (6)

3.15.1. Chlorek sodu, roztwór nasycony

3.15.2. Siarczan sodu bezwodny, granulowany

4. APARATURA I SPRZĘT

Stosowanie sprzętu szklanego, który nie był myty w kwasie, do sporządzania wodnych roztworów aflatoksyn może być przyczyną zaniżonych wyników. Szczególną uwagę należy zwrócić na nowy sprzęt szklany oraz sprzęt będący w dyspozycji, taki jak naczyńka do automatycznego podajnika próbek, pipety Pasteura. Dlatego sprzęt laboratoryjny, który kontaktuje się z wodnymi roztworami aflatoksyn, powinien być moczony w rozcieńczonym kwasie (np. kwasem siarkowym o stężeniu 2 mol/l) przez kilka godzin, następnie dokładnie płukany wodą destylowaną w celu usunięcia pozostałości kwasu (np. trzy razy, sprawdzić pH papierkiem). W praktyce, stosowanie tych zaleceń jest niezbędne w przypadku używania kolb okrągłodennych (4.4), kolb miarowych, cylindrów miarowych, naczyniek lub probówek stosowanych do roztworów kalibracyjnych i końcowych ekstraktów (zwłaszcza naczyniek do automatycznego podajnika próbek) i pipet Pasteura, jeżeli są używane do przenoszenia roztworów kalibracyjnych lub ekstraktów.

4.1. Rozdrabniacz

4.2. Sito o boku oczka kwadratowego 1 mm

4.3. Wstrząsarka mechaniczna

4.4. Obrotowy odparowywacz próżniowy, wyposażony w kolby okrągłodenne o pojemności 150 i 250 ml

4.5. Wysokosprawny chromatograf cieczowy, dozownik z pętlą umożliwiający zadozowanie 250 µl. Patrz instrukcja użytkowania dotycząca częściowego lub całkowitego napełniania pętli.

4.6. Analityczna kolumna HPLC: faza C₁₈, 3 µm lub 5 µm

4.7. Bezpulsacyjna pompa dostarczająca odczynnik jodowy do derywatyzacji pokolumnowej

4.8. Zawór Valco o zerowej objętości martwej w kształcie litery T, ze stali nierdzewnej (1/16" x 0,75mm)

4.9. Spirala reakcyjna teflonowa lub ze stali nierdzewnej; wymiary 3.000 x 0,5 mm do 5.000 x 0,5 mm, odpowiednie do połączenia z kolumnami HPLC 5 m lub 3 µm.

4.10. Łaźnia wodna kontrolowana termostatycznie, ustawiona na temperaturę 60°C, umożliwiająca regulację temperatury z dokładnością większą niż 0,1°C.

4.11. Detektor fluorescencyjny o wzbudzeniu przy 365 nm i emisji przy 435 nm długości fali świetlnej (w przypadku aparatów wyposażonych w filtry - długość fali emisji powyżej 400 nm). Możliwy poziom oznaczalności powinien wynosić co najmniej 0,05 ng aflatoksyny B₁. Wskazana jest możliwość uzyskania ciśnienia zwrotnego (np. przy użyciu restryktora, spirali teflonowej lub ze stali nierdzewnej podłączonej u wylotu detektora) w celu usunięcia pęcherzyków powietrza z kuwety przepływowej.

4.12. Rejestrator

4.13. Elektroniczny integrator (zamiennie)

4.14. Karbowany sączek bibułowy, 24 cm, Macherrey-Nagel 617 1/4 lub podobny

4.15. Filtr membranowy o wielkości porów 0,45 µm, Milipore HAWP04700 lub podobny

4.16. Kolba stożkowa ze szklanym korkiem, o pojemności 500 ml

4.17. Kolumna szklana (średnica wewnętrzna około l cm, długość około 30 cm), wyposażona w końcówkę Luera

4.18. Kurek Luera odporny na chloroform (np. Bio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J.T. Baker 4514 lub podobne).

4.19. Strzykawka odporna na działanie substancji chemicznych, wyposażona w 10 ml nasadkę Luera

4.20. Strzykawka do HPLC, odpowiednia do zadozowania 250 µl (4.5)

4.21. Mikrostrzykawka 100 µl do przygotowania roztworów kalibracyjnych (sprawdzić metodą wagową, czy jej dokładność mieści się w przedziale 2%)

4.22. Kalibrowane probówki z korkiem szklanym, o pojemności 10 ml

4.23. Spektrofotometr, umożliwiający pomiary absorbancji w zakresie widma UV

4.24. Wyposażenie do przeprowadzenia testu sprawdzającego (6)

4.24.1. Rozdzielacz o pojemności 100 ml, wyposażony w teflonowy kurek, myty kwasem

4.24.2. Blok grzejny, temperatura 40 do 50°C

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić próbkę tak, aby przechodziła przez sito (4.2).

5.2. Badana część próbki

Odważyć 50 g przygotowanej próbki do kolby stożkowej (4.16).

5.3. Ekstrakcja

Do odważki (5.2) dodać 25 g Celitu (3.8), 250 ml chloroformu i 25 ml wody. Zamknąć kolbę i wstrząsać przez 30 minut na wstrząsarce mechanicznej (4.3). Przesączyć przez karbowany sączek (4.14). Zebrać 50 ml filtratu. Jeśli konieczne, pobrać mniejszą ilość filtratu i rozcieńczyć do 50 ml chloroformem tak, aby stężenie aflatoksyny B₁ było nie wyższe niż 4 ng/ml.

5.4. Oczyszczanie (postępowanie powinno być prowadzone bez istotnych przerw)

W czasie wykonywania analizy chronić pomieszczenia laboratoryjne przed dziennym światłem. Można to uzyskać poprzez założenie na okna folii pochłaniającej promieniowanie UV z równoczesnym przytłumieniem dostępu światła (brak dostępu światła słonecznego) oraz poprzez założenie zasłon lub żaluzji w połączeniu ze sztucznym światłem (akceptowane jest światło jarzeniowe).

Roztwory zawierające aflatoksyny powinny być zabezpieczone przed światłem najlepiej jak to możliwe (roztwory powinny być przechowywane w ciemności w kolbach zabezpieczonych folią aluminiową).

5.4.1. Oczyszczanie przy użyciu mikrokolumny Florisil (Waters SEP-PAK)

5.4.1.1. Przygotowanie zestawu kolumny szklanej i mikrokolumny

Podłączyć kurek (4.18) do krótszej końcówki mikrokolumny z wypełnieniem Florisil (Waters SEP-PAK) (3.9) (rys. 6). Przemyć mikrokolumnę, stosując 10 ml chloroformu (3.1), przepuszczając szybko 8 ml przez kurek i mikrokolumnę przy użyciu strzykawki (4.19). Podłączyć dłuższą końcówkę mikrokolumny do szklanej kolumny (4.17) i przepuścić pozostałe 2 ml chloroformu przez mikrokolumnę do kolumny. Zamknąć kurek. Odłączyć strzykawkę.

5.4.1.2. Oczyszczanie

Wprowadzić przesącz otrzymany zgodnie z (5.3) do kolumny z przyłączoną mikrokolumną i odsączyć. Spłukać kolumnę przy użyciu 5 ml chloroformu (3.1) i 20 ml metanolu (3.2). Odrzucić eluaty. W czasie tych czynności nie wolno dopuścić, aby wypełnienie mikrokolumny pozostawało suche.

Eluować aflatoksynę B₁ przy użyciu 40 ml mieszaniny aceton - woda (3.5.1) i zebrać całkowicie eluat do kolby okrągłodennej odparowywacza obrotowego (4.4). Zatężyć eluat na odparowywaczu obrotowym (4.4) w temperaturze od 40 do 50°C aż do całkowitego oddestylowania acetonu. (Około 0,5 ml cieczy pozostaje w kolbie w tym momencie. Badania wykazały, że dalsze odparowywanie nie wpływa na wyniki, a w 0,5 ml pozostałości nie występują istotne ilości acetonu. Pozostałości acetonu mogą powodować straty aflatoksyny B₁ na mikrokolumnie wypełnionej fazą C₁₈).

Dodać l ml metanolu (3.2), poruszać kolbą ruchem okrężnym w celu rozpuszczenia aflatoksyny B₁ ze ścianek kolby, dodać 3 ml wody i zamieszać. Odłączyć i odrzucić mikrokolumnę. Spłukać wodą kolumnę szklaną i przejść do etapu oczyszczania na mikrokolumnach z wypełnieniem C₁₈.

5.4.2. Oczyszczanie przy użyciu mikrokolumny SEP-PAK C₁₈ (3.10).

5.4.2.1. Przygotowanie zestawu kolumny i mikrokolumny

Podłączyć kurek (4.18) do krótszej końcówki mikrokolumny z wypełnieniem C₁₈ (3.10) (rys. 6). Napełnić mikrokolumnę, usuwając pęcherzyki powietrza, stosując 10 ml metanolu (3.2), przepuszczając szybko metanol przez kurek i mikrokolumnę przy użyciu strzykawki (4.19) (pęcherzyki powietrza w mikrokolumnie są widoczne jako jasne punkty na szarym tle). Pobrać 10 ml wody i przepuścić 8 ml przez mikrokolumnę (nie dopuścić do wprowadzenia powietrza do mikrokolumny przy przejściu od metanolu do wody). Podłączyć dłuższą końcówkę mikrokolumny do kolumny szklanej (4.17) i przepuścić pozostałe 2 ml chloroformu przez mikrokolumnę do kolumny. Zamknąć kurek. Odłączyć strzykawkę.

5.4.2.2. Oczyszczanie

Przenieść ilościowo ekstrakt uzyskany według (5.4.1.2) do kolumny szklanej (4.17), spłukując kolbę dwukrotnie mieszaniną woda/metanol (3.5.2) w ilości 5 ml i przesączyć. Podczas tych czynności zwrócić uwagę, aby wypełnienie mikrokolumny nie pozostawało suche. (W przypadku gdy w pobliżu mikrokolumny utworzą się pęcherzyki powietrza, należy przerwać przesączanie i, lekko uderzając w górny koniec kolumny, doprowadzić do usunięcia powietrza. Następnie kontynuować pracę). Eluować przy użyciu 25 ml mieszaniny wody i metanolu. Odrzucić eluat. Eluować aflatoksynę B₁ przy użyciu 50 ml mieszaniny (3.5.3) woda/ aceton i zebrać cały eluat do kolby miarowej o pojemności 50 ml. Dopełnić do kreski wodą i zamieszać. Uzyskany roztwór jest stosowany do chromatografii (5.5).

Sączenie końcowego ekstraktu przed chromatografią HPLC zwykle nie jest konieczne. Jeżeli jednak okaże się to niezbędne, nie należy stosować sączków celulozowych ze względu na możliwe straty aflatoksyny B₁. Można stosować filtry teflonowe.

5.5. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

Na rys. 7 pokazano sposób połączenia zestawu. Pozwolić na ustabilizowanie warunków pracy aparatu.

- Szybkości przepływu fazy ruchomej i odczynnika jodowego po kolumnie są tylko wskaźnikowe. Parametry te powinny być ustalone w zależności od charakterystyki kolumny HPLC.

- Przy oznaczaniu aflatoksyny B₁ sygnał detektora zależy od temperatury, dlatego należy skompensować dryf temperaturowy (rys. 8). Dozując na kolumnę chromatograficzną określone ilości aflatoksyny B₁ poprzez wzorzec (3.13.3) w regularnych odstępach czasu (np. co trzecie wstrzyknięcie), piki aflatoksyny B₁ mogą być skorygowane poprzez uśrednienie sygnału, w przypadku gdy różnice pomiędzy kolejnymi porównawczymi wzorcami są bardzo małe (< 10%). Dozowanie roztworów badanych i wzorcowych powinno być prowadzone bez przerw. Jeżeli przerwa jest nieunikniona, ostatnie dozowanie przed przerwą i pierwsze dozowanie po przerwie powinno być uznawane jako odnośnik (3.13.3).

Z uwagi na prostoliniowość krzywej kalibracyjnej i przechodzenie przez początek układu współrzędnych, zawartości aflatoksyny B₁ w badanych ekstraktach są określane przez bezpośrednie odniesienie do roztworów wzorcowych.

5.5.1. Ustawianie pompy HPLC

Ustawić pompę HPLC (4.5) na przepływ 0,5 lub 0,3 ml/min odpowiednio dla kolumny HPLC 5 µm lub 3 µm, stosując fazę ruchomą (3.6).

5.5.2. Ustawianie pompy pokolumnowej

Ustawić pompę (4.7) na przepływ nasyconego, wodnego roztworu jodu (3.7) od 0,2 do 0,4 ml/min. Uwzględnić następującą regułę: przepływy 0,4 lub 0,2 ml/min są polecane w powiązaniu z odpowiednimi przepływami fazy ruchomej (3.6), 0,5 i 0,3 ml/min.

5.5.3. Detektor fluorescencyjny

Ustawić detektor fluorescencyjny (4.11) na wzbudzenie = 365 nm i emisję = 435 nm (w aparatach wyposażonych w filtry > 400 nm). Ustawić wzmocnienie detektora na takim poziomie, aby wychylenie pisaka wynosiło 80% skali dla l ng aflatoksyny B₁.

5.5.4. Dozownik

W przypadku wszystkich roztworów dozować 250 µl ilości, zgodnie z instrukcją obsługi dozownika.

5.5.5. Ustawianie chromatograficznego rozdziału

Zadozować roztwór (3.14.1). Doliny pomiędzy pikami powinny stanowić mniej niż 5% sumy wysokości kolejnych pików.

5.5.6. Sprawdzanie stabilności układu

Przed każdą serią oznaczeń dozować kolejno roztwór wzorcowy odniesienia (3.13.3) aż do uzyskania powtarzalnych powierzchni pików (wysokości lub powierzchnie pików kolejnych dozowań mogą się różnić nie więcej niż 6%). Przeprowadzić niezwłocznie sprawdzian liniowości (5.5.7).

5.5.7. Sprawdzenie liniowości

Dozować roztwory kalibracyjne aflatoksyny B₁ (od (3.13.1) do (3.13.4)). Za każdym trzecim razem dozować wzorzec odnośnikowy (3.13.3) w celu korekty dryfu (sygnały pochodzące od wzorca odnośnikowego (3.13.3) nie mogą się różnić więcej niż o 10% w czasie 90 minut). Skorygować dryf według wzoru w (7). Wykres kalibracyjny powinien być liniowy i przechodzić przez początek układu współrzędnych, przyjmując podwójny standardowy błąd szacowania Y. Znalezione wartości nie mogą się różnić więcej niż o 3% od wartości nominalnych. Jeżeli te warunki są spełnione, kontynuować oznaczanie. Jeżeli nie, określić i skorygować źródła rozbieżności przed kontynuacją.

5.5.8. Dozowanie próbek ekstraktów

Dozować oczyszczone próbki ekstraktów (5.4.2.2.). Po zadozowaniu każdych dwóch próbek ekstraktu powtarzać dozowanie wzorca odnośnikowego (3.13.3) zgodnie z poniższą sekwencją: wzorzec odniesienia, ekstrakt, ekstrakt, wzorzec odniesienia, ekstrakt, ekstrakt, wzorzec odniesienia itp.

6. TEST POTWIERDZAJĄCY

6.1. Dalszy etap postępowania z ekstraktem (5.4.2.2)

Dodać 5 ml roztworu chlorku sodu (3.15.1) do końcowego ekstraktu otrzymanego według (5.4.2.2). Ekstrahować trzykrotnie, stosując każdorazowo po 2 ml chloroformu (3.1) w czasie l minuty, w rozdzielaczu (4.2.4.1). Nanosić chloroformowe ekstrakty na warstwę siarczanu sodu (3.15.2) i zbierać w probówce o pojemności 10 ml. Do ekstrakcji należy użyć małego rozdzielacza (średnica 4 cm), przy czym siarczan sodu nałożyć na zwitek waty.

Przemyć siarczan sodu przy użyciu kilku ml chloroformu i zebrać popłuczyny w tej samej probówce. Odparować chloroformowy ekstrakt do sucha z tej samej probówki przy użyciu bloku grzejnego (4.24.2) i ponownie rozpuścić pozostałość w l ml chloroformu.

6.2. Przygotowanie cienkowarstwowej chromatografii połączonej z derywatyzacją:

Postępować zgodnie z metodą podaną w (Rozdział 8, 8.1, (5.6.2)).

7. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość aflatoksyny B₁ (µg/kg) w próbce według wzoru:

                                     m * Vczt

zawartość aflatoksyny B₁ w µg/kg = ---------------,

                                  Vm * M * Vf/Vc

gdzie:

m -   ilość aflatoksyny B₁ w ng, odpowiadająca zarejestrowanemu pikowi, obliczona w następujący sposób:

       P (próbka)

m = ----------------- x 2 r (st)

    P(st1) + P(st2)

P (próbka) - pole powierzchni piku aflatoksyny B₁ odpowiadające badanej próbce;

P (st1) - pole powierzchni piku aflatoksyny B₁ odpowiadające poprzedniemu zadozowaniu wzorca odniesienia (3.13.3);

P (st2) - pole powierzchni piku aflatoksyny B₁ odpowiadające następnemu zadozowaniu wzorca odniesienia (3.13.3);

r (st) - ilość aflatoksyny B₁ w ng, zadozowana na kolumnę z wzorcem odniesienia (3.13.3); Vm - objętość zadozowanego na kolumnę ekstraktu próbki, w ml;

Vczt - końcowa objętość ekstraktu próbki, w ml, uwzględniająca wszelkie rozcieńczenia w toku postępowania (5.3);

M - masa próbki, w g;

Vf - objętość przesączu przeniesiona na mikrokolumnę z wypełnieniem Florisil (5.4.1.2), w ml;

Vc - objętość chloroformu użyta do ekstrakcji próbki, w ml;

Jeżeli sposób postępowania jest zgodny z tu przedstawionym, wzór upraszcza się do postaci:

Zawartość aflatoksyny B₁ w µg/kg = 20 x m.

7.1. Obliczanie wyników można prowadzić na podstawie pomiaru wysokości pików.

8. OBJAŚNIENIA

8.1. Stabilizacja chloroformu (3.1)

Charakterystyki absorpcji na Florisilu mogą się zmienić przy stosowaniu stabilizatorów innych niż etanol. Gdy zalecany chloroform jest niedostępny, należy sprawdzić wynik analizy zgodnie z zaleceniami podanymi w (8.2).

8.2. Dokładność

Poprawność wykonania oznaczenia przy użyciu niniejszej metody może być sprawdzona poprzez wykonywanie wielokrotnych pomiarów certyfikowanego materiału odniesienia. Jeżeli taki materiał nie jest dostępny, dokładność oznaczania powinna być zweryfikowana poprzez oznaczanie stopnia odzysku aflatoksyny B₁ dodanej do próbki paszy niezawierającej aflatoksyn. Procentowa zmienność stopnia odzysku powinna zawierać się w przedziale od -20% do +10% w stosunku do rzeczywistej zawartości.

grafika

rys. 9 Zestaw kolumnowy z mikrokolumną

grafika

rys. 10 Przepływowy diagram systemu LC z derywatyzacją pokolumnową

1. Faza ruchoma

2. Pompa

3. Zawór dozownika

4. Przedkolumna

5. Kolumna analityczna HPLC

6. Nasycony roztwór jodu

7. Pompa odczynnikowa

8. Łącznik T

9. Termostatowana łaźnia

10. Spirala reakcyjna

11. Detektor fluorescencyjny

12. Restryktor

13. Odciek

14. Rejestrator lub integrator

grafika

rys. 11 Kompensacja dryfu przy oznaczeniu aflatoksyny B₁ poprzez dozowanie wzorca odniesienia (3.13.3) w regularnych odstępach

8.3. OZNACZANIE TEOBROMINY

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości teobrominy w produktach ubocznych otrzymywanych w procesie obróbki nasion kakao.

2. ZASADA METODY

Teobromina jest ekstrahowana chloroformem. Ekstrakt odparowuje się do sucha, rozpuszcza w wodzie i zadaje określoną ilością roztworu azotanu srebra. Uwolniony kwas azotowy jest miareczkowany roztworem wodorotlenku sodu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Chloroform

3.2. Amoniak, d = 0,958 g/ml

3.3. Siarczan sodu, bezwodny

3.4. Roztwór wodorotlenku sodu o stężeniu 0,1 mol/l

3.5. Roztwór azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l

3.6. Roztwór czerwieni fenolowej w etanolu, 1% (w/v)

3.7. Eter naftowy, temperatura wrzenia 40 - 60°C

4. APARATURA I SPRZĘT

Kolby płaskodenne o pojemności 500 ml, z korkami szklanymi

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć, z dokładnością do l mg, nie więcej niż 10 g próbki zawierającej nie więcej niż 80 mg teobrominy, umieścić w 500 ml kolbie płaskodennej z korkiem i dodać 270 ml chloroformu (3.1) i 10 ml amoniaku (3.2). Zamknąć kolbę korkiem i energicznie wstrząsać przez 5 minut. Dodać 12 g bezwodnego siarczanu sodu (3.3), ponownie wstrząsnąć i pozostawić do następnego dnia. Przesączyć do zlewki Erlenmeyera o pojemności 500 ml i pozostałość przemyć 100 ml chloroformu (3.1). Roztwór destylować i odrzucić ostatni wyciek. Ponownie rozpuścić ekstrakt w 50 ml wody i zagotować. Oziębić, zobojętnić dokładnie roztworem wodorotlenku sodu (3.4) przy użyciu 0,5 ml roztworu czerwieni fenolowej (3.6). Dodać 20 ml roztworu azotanu srebra (3.5). Miareczkować uwolniony kwas azotowy roztworem wodorotlenku sodu (3.4) do zmiany barwy wskaźnika (pH 7,4).

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość teobrominy według wzoru:

    V * 18

X = --------,

    m * 10

w którym:

X -  zawartość teobrominy, w %,

V -  objętość 0,1 M NaOH zużytego do miareczkowania (1 ml 0,1 M NaOH odpowiada 18 mg teobrominy),

m -  masa odważki, w g.

7. OBJAŚNIENIA

Produkty zawierające więcej niż tylko 8% tłuszczu surowego należy odtłuścić eterem naftowym (3.7), ekstrahując tłuszcz w czasie 6 godzin.

8.4. OZNACZANIE OLEJKU GORCZYCZNEGO

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości olejku gorczycznego w makuchach z rzepaku i gorczycy oraz w mieszankach paszowych zawierających makuchy pochodzące z tych roślin, wyrażonego jako izotiocyjanian allilu, uwolniony przez parę wodną.

2. ZASADA METODY

Zasada metody polega na utworzeniu z próbki wodnej suspensji, uwolnieniu olejku gorczycznego za pomocą enzymów, oddestylowaniu z roztworu etanolu i zebraniu w rozcieńczonym amoniaku. Ciepły roztwór zadaje się znaną objętością roztworu azotanu srebra, oziębia i sączy. Nadmiar azotanu srebra miareczkuje się roztworem tiocyjanianu amonu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Biała gorczyca (Sinapis alba)

3.2. Etanol, 95 do 96% (V/V)

3.3. Emulsja przeciwpieniąca (np. silikonowa)

3.4. Amoniak, d = 0,958

3.5. Roztwór azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l

3.6. Roztwór tiocyjanianu amonu o stężeniu 0,1 mol/l

3.7. Kwas azotowy, d = 1,40

3.8. Nasycony roztwór siarczanu żelaza i amonu

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Kolby płaskodenne o pojemności 500 ml, ze szklanymi korkami

4.2. Aparatura do destylacji składająca się z chłodnicy z wyposażenia zabezpieczającego przed ściekaniem kropel do kolby.

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć 10 g próbki, z dokładnością do l mg, umieścić w kolbie z płaskim dnem o pojemności 500 ml i dodać 2 g rozdrobnionej białej gorczycy (3.1) (jako źródło enzymów) i 200 ml wody o temperaturze 20°C. Zamknąć kolbę i utrzymywać w temperaturze 20°C przez około 2 godziny, często wstrząsając. Dodać 40 ml etanolu (3.2) i jedną kroplę emulsji przeciwpieniącej (3.3). Oddestylować około 150 ml mieszaniny i zebrać destylat w 250 ml kolbie miarowej zawierającej 20 ml amoniaku (3.4), upewniając się, że koniec chłodnicy jest zanurzony w cieczy. Dodać do amoniakalnego roztworu 50 ml azotanu srebra (3.5) (lub więcej w razie potrzeby), umieścić mały lejek nad kolbą i ogrzewać mieszaninę przez godzinę na wrzącej łaźni wodnej. Oziębić, uzupełnić kolbę do kreski wodą, wymieszać i przesączyć, pobrać 100 ml klarownego filtratu, dodać 5 ml kwasu azotowego (3.7) i około 5 ml roztworu siarczanu żelaza i amonu (3.8). Miareczkować nadmiar azotanu srebra roztworem tiocyjanianu amonu (3.6).

Przeprowadzić ślepą próbę, stosując to samo postępowanie i 2 g rozdrobnionej gorczycy z pominięciem próbki do analizy.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Od ilości roztworu azotanu srebra zużytego na miareczkowanie ślepej próby odjąć ilość zużytą na miareczkowanie roztworu próbki. Otrzymana objętość roztworu azotanu srebra o stężeniu 0,1 mol/l oznacza objętość związaną przez olejek gorczyczny. 1 ml AgNO₃ o stężeniu 0,1 mol/l odpowiada 4,956 mg izotiocyjanianu allilu. Wynik wyrazić jako procentową zawartość izotiocyjanianu allilu w próbce.

8.5. OZNACZANIE KWASU CYJANOWODOROWEGO

1. CEL I ZAKRES

Opisano metodę oznaczania zawartości kwasu cyjanowodorowego, występującego w postaci wolnej, jak również w połączeniu z glukozydami, w surowcach paszowych, a szczególnie w produktach z siemienia lnianego, manioku i niektórych gatunków nasion strączkowych.

2. ZASADA METODY

Po utworzeniu zawiesiny próbki w wodzie uwalnia się kwas cyjanowodorowy pod wpływem enzymów, a następnie oddziela się w drodze destylacji z parą wodną i zbiera w odpowiedniej objętości zakwaszonego roztworu azotanu srebra. Powstały cyjanek srebra oddziela się na sączku, a nadmiar azotanu srebra miareczkuje się roztworem tiocyjanianu amonu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Zawiesina ze słodkich migdałów. Rozdrobnić 20 wyłuskanych słodkich migdałów i wrzucić do 100 ml wody o temperaturze od 37 do 40°C. Sprawdzić, czy w zawiesinie nie ma kwasu cyjanowodorowego w ten sposób, że 10 ml zawiesiny nanieść na papierek pikrynowy lub wykonując ślepą próbę, jak opisano w (5).

3.2. Roztwór octanu sodu, 10% (w/v), obojętny wobec fenoloftaleiny

3.3. Emulsja przeciwpieniąca (np. silikonowa)

3.4. Kwas azotowy, d = 1,4 g/ml

3.5. Roztwór azotanu srebra o stężeniu 0,02 mol/l

3.6. Roztwór tiocyjanianu amonu o stężeniu 0,02 mol/l

3.7. Nasycony roztwór siarczanu żelaza i amonu

3.8. Amoniak, d = 0,958 g/ml

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Suszarka z termostatem ustawionym na temperaturę 38°C

4.2. Aparatura do destylacji z parą wodną z zakrzywionym końcem

4.3. Kolby płaskodenne ze szklanymi korkami, o pojemności 1.000 ml

4.4. Łaźnia olejowa

4.5. Biureta z podziałką w zakresie 1/20 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć 20 g próbki, z dokładnością do 5 mg, umieścić w 1-litrowej kolbie płaskodennej i dodać kolejno 50 ml wody i 10 ml zawiesiny słodkich migdałów (3.1). Zamknąć kolbę i umieścić w suszarce na 16 godzin, ustawionej na temperaturę 38°C. Następnie ochłodzić do temperatury pokojowej i dodać 80 ml wody, 10 ml roztworu octanu sodu (3.2) i kroplę emulsji przeciwpieniącej (3.3).

Połączyć kolbę z aparaturą do destylacji z parą wodną i umieścić w łaźni olejowej, którą należy uprzednio rozgrzać do temperatury 100°C. Oddestylować od 200 do 300 ml cieczy z parą wodną i łagodnie ogrzewając kolbę. Destylat zebrać w zlewce Erlenmeyera osłoniętej od światła i zawierającej dokładnie 50 ml roztworu azotanu srebra (3.5) i 1 ml kwasu azotowego (3.4). Upewnić się, że koniec chłodnicy jest zanurzony w roztworze azotanu srebra.

Zawartość kolby Erlenmeyera przenieść do 500 ml kolby miarowej i uzupełnić kolbę do kreski, wymieszać i przesączyć. Odrzucić 250 ml filtratu i dodać około 1 ml roztworu siarczanu żelaza i amonu (3.7) i nadmiar azotanu srebra miareczkować roztworem tiocyjanianu amonu (3.6) z biurety z podziałką w zakresie 1/20 ml.

Próbę ślepą przeprowadza się tą samą techniką, używając 10 ml zawiesiny słodkich migdałów (3.1), bez próbki analitycznej.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Obliczyć zawartość kwasu cyjanowodorowego HCN według wzoru:

    (V - V_o) * 0,54

X = -----------------,

         M * 10

w którym:

X -   zawartość kwasu cyjanowodorowego, w %,

V -   objętość 0,02 N NaOH zużytego do miareczkowania próby badanej (1 ml odpowiada 0,54 mg HCN), w ml,

V_o -  objętość 0,02 N NaOH zużytego do miareczkowania ślepej próby, w ml,

M -   masa próbki, w g.

7. OBJAŚNIENIA

Jeśli próbka zawiera znaczne ilości siarczków (np. strączkowe), wytrąca się czarny osad siarczku srebra, który zostaje na sączku wraz z osadem cyjanku srebra. Tworzenie siarczku srebra powoduje straty roztworu azotanu srebra 0,02 N i wartość tę należy odjąć od objętości użytej do obliczania zawartości HCN. Czynność tę należy wykonać w poniższy sposób.

Pozostały na sączku osad zadać 50 ml amoniaku (3.8) w celu rozpuszczenia cyjanku srebra. Pozostałość przemyć rozcieńczonym amoniakiem i następnie oznaczyć w niej zawartość srebra. Przeliczyć otrzymaną wartość na ilość ml roztworu azotanu srebra 0,02 N.

Zawartość HCN w próbce można też oznaczyć, miareczkując zakwaszony amoniakalny przesącz kwasem azotowym.

8.6. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI ALKALOIDÓW W ŁUBINIE

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości alkaloidów w nasionach łubinu.

2. ZASADA METODY

Alkaloidy łubinu są rozpuszczane w mieszaninie eteru dietylowego i chloroformu. Ekstrahuje się je kwasem chlorowodorowym. Alkaloidy strąca się kwasem krzemowolframowym, spopiela osad i waży.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Eter dietylowy

3.2. Chloroform

3.3. Wodorotlenek sodu, roztwór o stężeniu 4 mol/l

3.4. Kwas chlorowodorowy, roztwór o stężeniu 0,3 mol/l

3.5. Chlorek sodu

3.6. Roztwór kwasu krzemowolframowego SiO₂ x 12WO₃ x 12H₂O, 10% (w/v)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Mieszadło magnetyczne

4.2. Tygle do spalań, platynowe, kwarcowe lub porcelanowe

4.3. Elektryczny piec do spalań

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć 15 g próbki, z dokładnością do 5 mg, i umieścić w naczyniu o pojemności około 200 ml. Zamknąć szklanym korkiem (np. rozdzielacz). Dodać dokładnie 100 ml eteru dietylowego (3.1) i 50 ml chloroformu (3.2), a następnie, przy użyciu pipety, 10 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.3). Energicznie wstrząsnąć, aby zapobiec zlepianiu się próbki. Ponownie wstrząsnąć kilkakrotnie i pozostawić na noc. Jeśli roztwór nie jest zupełnie klarowny, dodać kilka kropli wody. Przesączyć warstwę eterową. Zebrać 50 ml filtratu do 50 ml kolby miarowej i przenieść ilościowo do rozdzielacza o pojemności 150 ml za pomocą 50 ml eteru dietylowego (3.1). Ekstrahować kolejno trzykrotnie 20 ml porcjami kwasu chlorowodorowego (3.4), pozostawić do zdekantowania i zebrać po każdym procesie kwaśny ekstrakt. Połączyć kwaśne ekstrakty w zlewce o pojemności 250 ml i usunąć pozostałości eteru i chloroformu, łagodnie podgrzewając. Dodać około 1 g chlorku sodu (3.5), pozostawić do oziębienia i strącić alkaloidy roztworem kwasu krzemowolframowego (3.6). Mieszać mieszadłem magnetycznym przez 30 minut. Pozostawić na noc, potem przesączyć przez sączek bezpopiołowy i osad przemyć dwukrotnie, stosując po 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.4), a następnie dwukrotnie stosując po 5 ml tego kwasu (3.4). Sączek z osadem umieścić w tyglu i spopielać w temperaturze 900°C. Schłodzić w eksykatorze i zważyć.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Zawartość alkaloidów w próbce otrzymujemy, mnożąc masę popiołu przez współczynnik 0,2. Wynik wyrazić jako procentową zawartość alkaloidów w próbce.

8.7. SZACOWANIE AKTYWNOŚCI UREAZY W PRODUKTACH SOJOWYCH

1. CEL I ZAKRES

Opisano metodę szacowania aktywności ureazy w produktach sojowych celem wykazania, czy te produkty były poddawane obróbce termicznej przez wystarczająco długi okres.

2. ZASADA METODY

Aktywność ureazy jest określana na podstawie oznaczenia ilości uwolnionego azotu amonu z roztworu mocznika, w przeliczeniu na 1 g produktu na minutę, w temperaturze 30°C.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas chlorowodorowy o stężeniu 0,1 mol/l

3.2. Roztwór wodorotlenku sodu o stężeniu 0,1 mol/l

3.3. Roztwór fosforanowy o stężeniu 0,05 mol/l, zawierający w 1.000 ml 4,45 g dihydratu wodorofosforanu(V) disodu (Na₂HPO₄ x 2H₂O) i 3,40 g diwodorofosforanu(V) potasu (KH₂PO₄)

3.4. Roztwór mocznika, świeżo przygotowany, zawierający 30,0 g mocznika w 1.000 ml roztworu fosforanowego (3.3), pH 6,9 - 7,0

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Aparatura do miareczkowania potencjometrycznego lub pehametr o wysokiej czułości (0,02 pH), z mieszadłem magnetycznym

4.2. Łaźnia wodna z termostatem ustawiona dokładnie na temperaturę 30°C

4.3. Probówki ze szklanymi korkami o wymiarach 150 x 18 mm

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Rozdrobnić około 10 g próbki tak, aby przesiewała się przez sito o wymiarach oczka 0,2 mm. Odważyć ponad 0,2 g rozdrobnionej próbki, z dokładnością do 1 mg, i umieścić w probówce ze szklanym korkiem, następnie dodać 10 ml roztworu mocznika (3.4). Natychmiast zamknąć korkiem i wstrząsnąć energicznie. Probówkę umieścić w łaźni wodnej nastawionej dokładnie na temperaturę 30°C i utrzymywać dokładnie przez 30 minut. Szybko dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (3.1), szybko schłodzić do temperatury 20°C i przenieść ilościowo zawartość probówki do naczynia do miareczkowania, przemywając dwukrotne wodą w ilości po 5 ml. Stosując elektrodę szklaną (4.1), szybko miareczkować potencjometrycznie do pH 4,7 roztworem wodorotlenku sodu o stężeniu 0,1 mol/l (3.2).

Przeprowadzić test ślepej próby w następujący sposób. Szybko umieścić 0,2 g próbki, odważonej z dokładnością do 1 mg, w probówce ze szklanym korkiem, dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 0,1 mol/l (3.1), a następnie 10 ml roztworu mocznika (3.4). Szybko oziębić probówkę w łaźni lodowej i pozostawić na 30 minut. W warunkach opisanych powyżej przenieść zawartość probówki do naczynia filtracyjnego, używając roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 0,1 mol/l (3.2) do uzyskania pH 4,7.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Aktywność ureazy obliczyć według wzoru:

  mg N                1,4 (b - a)

--------- przy 30°C = ------------,

g x min                 30 x E

w którym:

a -  objętość roztworu 0,1 N wodorotlenku sodowego zużytego na miareczkowanie próbki, w ml,

b -  objętość roztworu 0,1 N wodorotlenku sodowego zużytego na miareczkowanie ślepej próby, w ml,

E -  masa próbki, w g.

7. OBJAŚNIENIA

7.1. Metoda jest odpowiednia do oznaczania aktywności ureazy do 1 mg N/g/min przy temperaturze 30°C. Dla produktów o większej aktywności ureazy należy zmniejszyć próbkę analityczną do 50 mg.

7.2. Produkty zawierające więcej niż 10% tłuszczu surowego muszą być najpierw odtłuszczone na zimno.

8.8. OZNACZANIE GOSSYPOLU

1. CEL I ZAKRES

Opisano metodę oznaczania zawartości wolnego gossypolu, całkowitego gossypolu i chemicznie związanych substancji w nasionach bawełny, mączce bawełnianej i w komponentach paszowych zawierających te substancje w ilości ponad 20 ppm.

2. ZASADA METODY

Wolny gossypol ekstrahuje się w obecności 3-aminopropan-1-olu lub mieszaniny propan-2-olu z heksanem lub dimetyloformamidem w celu oznaczenia całkowitego gossypolu. Gossypol łączy się z aniliną, tworząc barwny związek gossypol-dianilinę. Absorbancję mierzymy przy 440 nm.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Mieszanina 1-propan-2-ol-heksan: zmieszać 40 części objętościowych propan-2-olu cz.d.a. z 40 częściami objętościowymi n-heksanu.

3.2. Rozpuszczalnik A: umieścić w kolbie o pojemności 1 litra 500 ml mieszaniny propan-2-ol-heksanu (3.1), 2 ml 3-aminopropan-1-olu, 8 ml lodowatego kwasu octowego i 50 ml wody. Uzupełnić do kreski mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Odczynnik jest stabilny przez tydzień.

3.3. Rozpuszczalnik B: odpipetować 2 ml 3-aminopropan-1-olu i 10 ml lodowatego kwasu octowego do 100 ml kolby miarowej. Oziębić do temperatury pokojowej i uzupełnić kolbę do kreski N,N-dimetyloformamidem. Odczynnik jest stabilny przez tydzień.

3.4. Anilina cz.d.a.: jeśli gęstość optyczna ślepej próby przekracza 0,022, to należy wówczas przedestylować anilinę nad proszkiem cynku, odrzucając pierwsze i ostatnie 10% destylatu. Schłodzić i przechowywać w brązowej butelce zamkniętej korkiem. Odczynnik można przechowywać przez kilka miesięcy.

3.5. Wzorcowy roztwór gossypolu A: 27,9 mg octanu gossypolu umieścić w 250 ml kolbie miarowej. Rozpuścić i uzupełnić kolbę do kreski rozpuszczalnikiem (3.2). Odpipetować 50 ml roztworu do 250 ml kolby miarowej i uzupełnić do kreski rozpuszczalnikiem A. Stężenie gossypolu w tym roztworze wynosi 0/02 mg/ml. Przed użyciem pozostawić na godzinę w temperaturze pokojowej.

3.6. Roztwór wzorcowy gossypolu B: 27,9 mg octanu gossypolu umieścić w kolbie miarowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić i uzupełnić kolbę do kreski rozpuszczalnikiem B (3.3). Stężenie gossypolu w roztworze wynosi 0,5 mg/ml. Wzorcowe roztwory gossypolu A i B nadają się do użycia przez 24 godziny, jeśli są chronione przed światłem.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Mikser (tumbler): około 35 obr/min

4.2. Spektrofotometr

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Analiza próbki

Masa próbki analitycznej pobrana do analizy zależy od przewidywanej zawartości gossypolu w próbce. Zalecana jest praca na małych ilościach próby i stosunkowo dużej ilości przesączu po to, by wykonać w miarę możliwości precyzyjny pomiar. W przypadku oznaczania wolnego gossypolu w nasionach bawełny, mączce bawełnianej masa próbki do analizy nie może przekraczać 1 g. W przypadku komponentów paszowych może wynosić do 5 g. 10 ml porcja przesączu w większości przypadków jest wystarczająca. Powinna ona zawierać od 50 do 100 µg gossypolu. Jeśli oznaczamy całkowitą zawartość gossypolu, ilość badanej próbki może wynosić 0,5 - 5 g i wtedy 2 ml przesączu będzie zawierało od 40 do 200 µg gossypolu. Analizę należy przeprowadzać w temperaturze 20°C.

5.2. Oznaczanie wolnego gossypolu

Umieści próbkę w kolbie okrągłodennej o pojemności 250 ml. Dno kolby pokryć pokruszonym szkłem. Przy użyciu pipety dodać dokładnie 50 ml rozpuszczalnika A (3.2), zamknąć kolbę korkiem i mieszać przez 1 godzinę. Przesączyć przez suchy sączek i przesącz zebrać do małej kolby okrągłodennej. Podczas sączenia przykryć lejek szkiełkiem zegarkowym. Odmierzyć pipetą dwie identyczne porcje przesączu zawierającego od 50 do 100 µg gossypolu i umieścić w dwóch kolbach okrągłodennych o pojemności 25 ml (A i B). Jeśli zajdzie potrzeba, dodać do kolby 10 ml rozpuszczalnika A (3.2). Następnie uzupełnić kolbę (A) do kreski mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Roztwór będzie użyty jako roztwór odniesienia dla roztworu z próbką. Odpipetować po 10 ml rozpuszczalnika (3.2) do dwóch kolb miarowych o pojemności 25 ml (C i D). Kolbę C uzupełnić do kreski mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Roztwór ten będzie używany jako roztwór odniesienia względem pomiaru roztworu ślepej próby. Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do każdej z kolb (D) i (B). Ogrzewać na wrzącej łaźni przez 30 minut, do wywołania reakcji barwnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić kolbę mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1), zhomogenizować i odstawić na godzinę. Zmierzyć absorbancję roztworu ślepej próby (D), używając odpowiedniego roztworu (C) jako roztworu odniesienia. Następnie zmierzyć gęstość optyczną roztworu (B) przez porównanie z odpowiednim roztworem (A). Pomiary wykonać spektrofotometrycznie przy 440 nm, stosując kuwety o 1 cm drodze światła. Od wartości gęstości optycznej roztworu z próbą badaną odjąć gęstość optyczną ślepej próby. Dopiero przy użyciu tej różnicy obliczyć zawartość wolnego gossypolu, jak to pokazano w (6).

5.3. Oznaczanie całkowitego gossypolu

Próbkę zawierającą od 1 do 5 mg gossypolu umieścić w 50 ml kolbie miarowej i dodać 10 ml rozpuszczalnika B (3.3). W tym samym czasie przygotować ślepą próbę, umieszczając 10 ml rozpuszczalnika B (3.3) w następnej kolbie miarowej o pojemności 50 ml. Ogrzewać obie kolby przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej. Następnie oziębić do temperatury pokojowej i uzupełnić kolby do kreski mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Zhomogenizować i odstawić na 10 do 15 minut. Następnie przesączyć i przesącz zebrać do kolb płaskodennych. Odpipetować po 2 ml przesączu z próbką do każdej z dwu 25 ml kolb miarowych. Uzupełnić kolby o pojemności 25 ml do kreski mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1). Roztwory te będą używane jako roztwory odniesienia. Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do dwu pozostałych kolb miarowych. Ogrzewać obie kolby przez 30 minut na wrzącej łaźni wodnej do wywołania barwy. Oziębić do temperatury pokojowej, uzupełnić do 25 ml mieszaniną propan-2-ol-heksanu (3.1), wymieszać i pozostawić na godzinę. Zmierzyć gęstość optyczną tak jak w (5.2). Obliczyć całkowitą zawartość gossypolu w taki sposób, jak podano w (6).

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Wyniki mogą być obliczone na podstawie absorbancji właściwej (6.1) lub na podstawie krzywej wzorcowej (6.2).

6.1. Na podstawie absorbancji właściwej

W podanych warunkach absorbancje właściwe są następujące:

                     1%

Gossypol wolny     E ----- = 625,

                    1 cm

                     1%

Gossypol całkowity E ----- = 600.

                    1 cm

Zawartość gossypolu wolnego lub całkowitego w próbce jest określona według następującego wzoru:

                E x 1.250

  Gossypol % = -----------,

                  1%

              E ------- x p x a

                 1 cm

gdzie:

E -  absorbancja określona wg (5.2),

p -  masa próbki, w g,

a -  część przesączu, w ml.

6.2. W oparciu o krzywą wzorcową

6.2.1. Gossypol wolny

Przygotować dwie serie po 5 kolb miarowych o pojemności 25 ml. Do każdej serii wprowadzić pipetą do kolb odpowiednio 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego A gossypolu (3.5). Uzupełnić objętości do 10 ml rozpuszczalnikiem A (3.2). Uzupełnić każdą serię próbką odniesienia zawierającą jedynie 10 ml rozpuszczalnika A (3.2) w kolbie o pojemności 25 ml.

Uzupełnić do 25 ml objętości roztworów w pierwszej serii (w tym roztwór kontrolny) mieszaniną izopropanol-heksanu (3.1) (seria odniesienia).

Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do każdej kolby drugiej serii (w tym do roztworu kontrolnego). Ogrzewać przez 30 min na wrzącej łaźni wodnej celem wywołania barwy. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do kreski mieszaniną izopropanol-heksanu, wymieszać i odstawić na godzinę.

Zmierzyć absorbancję roztworów serii wzorcowej w warunkach podanych w (5.2) w odniesieniu do odpowiadających roztworów serii odniesienia. Wykreślić krzywą wzorcową, odnosząc wartości absorbancji do ilości gossypolu w µg.

6.2.2. Gossypol całkowity

Przygotować 6 kolb miarowych o pojemności 50 ml. Do pierwszej kolby dodać 10 ml rozpuszczalnika B (3.3), a do pozostałych odpowiednio 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 i 10,0 ml roztworu wzorcowego B gossypolu (3.6). Uzupełnić objętości w każdej kolbie do 10 ml rozpuszczalnikiem B (3.3). Ogrzewać przez 30 min na wrzącej łaźni wodnej. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do kreski mieszaniną izopropanol-heksanu (3.1) i wymieszać.

Wprowadzić po 2 ml tych roztworów do dwóch serii po 6 kolb miarowych o pojemności 25 ml. Uzupełnić do 25 ml objętości kolb pierwszej serii mieszaniną izopropanol-heksanu (3.1) (seria odniesienia).

Dodać po 2 ml aniliny (3.4) do każdej kolby drugiej serii. Ogrzewać przez 30 min na wrzącej łaźni wodnej celem wywołania barwy. Schłodzić do temperatury pokojowej, uzupełnić do kreski mieszaniną izopropanol-heksanu (3.1), wymieszać i odstawić na godzinę (seria wzorcowa).

Zmierzyć absorbancję roztworów serii wzorcowej w warunkach podanych w (5.2) w odniesieniu do odpowiadających roztworów serii odniesienia. Wykreślić krzywą wzorcową, odnosząc wartości absorbancji do ilości gossypolu w µg.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie może przekraczać:

-   15% wartości względnej dla zawartości gossypolu poniżej 500 mg/kg,

-   75 mg/kg wartości bezwzględnej dla zawartości od 500 do 750 mg/kg,

-   10% wartości względnej dla zawartości powyżej 750 mg/kg.

8.9. WYTYCZNE DO MIKROSKOPOWEJ IDENTYFIKACJI I OZNACZANIA SKŁADNIKÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO

1. CEL I ZAKRES

Zaleca się stosowanie wytycznych wówczas, gdy wykrywanie składników pochodzenia zwierzęcego w paszach (zdefiniowanych jako produkty pozyskane podczas przetwarzania tusz lub części tusz ssaków, drobiu i ryb) jest przeprowadzane metodą badania mikroskopowego. W przypadku oznaczania składników pochodzenia zwierzęcego należy spełnić warunki podane w (7).

2. CZUŁOŚĆ

Prezentowaną metodą mogą być wykrywane bardzo małe ilości składników pochodzenia zwierzęcego w paszach (< 0,1%), zależnie od natury tych składników.

3. ZASADA METODY

Do badań wykorzystywana jest reprezentatywna próbka, pobrana zgodnie z zaleceniami i poddana odpowiedniemu przygotowaniu. Składniki pochodzenia zwierzęcego są oznaczane na podstawie typowych cech identyfikowanych pod mikroskopem (tj. włókna mięśniowe i inne cząstki mięsa, tkanka chrzęstna, kości, rogi, włosie, szczecina, krew, pióra, skorupy jaj, ości ryb, łuski). Identyfikacji należy poddać frakcję sitową (6.1) i skoncentrowany osad (6.2) z próbki.

4. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

4.1. Czynnik zanurzeniowy

4.1.1. Hydrat chloralu (roztwór wodny, 60% w/v)

4.1.2. Olej parafinowy

4.2. Czynniki zagęszczający

4.2.1. Tetrachloroetylen (gęstość 1,62)

4.3. Czynniki barwiące

4.3.1. Odczynnik Bradforda

4.3.2. Roztwór jodu w jodku potasu

4.3.3. Odczynnik Millona

4.3.4. Odczynnik cystynowy (2 g octanu ołowiu, 10 g NaOH/100 ml H₂O)

Wymienione odczynniki mogą być zastąpione innymi, pozwalającymi na uzyskanie porównywalnych wyników.

5. APARATURA I SPRZĘT

5.1. Waga analityczna (dokładność 0,001 g)

5.2. Sprzęt do rozdrabniania (tarka, młynek itp.)

5.3. Sito z siatką o kwadratowych oczkach o wymiarach 0,1 do 2 mm

5.4. Mikroskop stereoskopowy (powiększenie do 50 x)

5.5. Mikroskop sprzężony (powiększenie do 400 x), światło przechodzące/światło spolaryzowane

5.6. Standardowe szkło laboratoryjne

6. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Przygotować co najmniej 10 g rozdrobnionej próbki, zależnie od rodzaju materiału (rozdrobnienie granul lub zmielenie za pomocą odpowiedniego sprzętu), a następnie podzielić na dwie reprezentatywne części, jedna o masie co najmniej 5 g do analizy sitowej (6.1), druga o masie co najmniej 2 g do badania zagęszczonego osadu (6.2). Do identyfikacji zalecane jest stosowanie odczynników barwiących (6.3).

6.1. Identyfikacja składników pochodzenia zwierzęcego w frakcjach sitowych

Co najmniej 5 g próbki przesiać przez sita (5.3), uzyskując co najmniej dwie frakcje.

Frakcję (lub frakcje) sitową > 0,5 mm (lub reprezentatywną część frakcji) rozsypać równomiernie w postaci cienkiej warstwy na odpowiednim podłożu i systematycznie przeglądać pod mikroskopem stereoskopowym (5.4) przy różnych powiększeniach, poszukując składników pochodzenia zwierzęcego.

Slajdy wykonane z frakcji sitowych < 0,5 mm systematycznie przeglądać pod mikroskopem sprzężonym (5.5) przy różnych powiększeniach, poszukując składników pochodzenia zwierzęcego.

6.2. Identyfikacja składników pochodzenia zwierzęcego w zagęszczonym osadzie

Odważyć co najmniej 2 g próbki (z dokładnością do 0,001 g) do probówki lub rozdzielacza i dodać co najmniej 15 ml tetrachloroetylenu (4.2.1). Po kilkakrotnym zamieszaniu/wstrząśnięciu mieszaniny i odstawieniu jej na dostatecznie długi okres (co najmniej na 1 minutę, ale nie dłużej niż na dwie do trzech minut) osad oddziela się.

Suszyć osad pod wyciągiem, następnie zważyć (z dokładnością do 0,001 g). Ważenie jest potrzebne tylko i wyłącznie w przypadku wykonywania oznaczenia ilościowego. Zbadać osad lub jego część pod kątem obecności składników kostnych pod mikroskopem stereoskopowym (5.4) i mikroskopem sprzężonym (5.5).

6.3. Stosowanie substancji zanurzeniowych i odczynników barwiących

W mikroskopowej identyfikacji składników pochodzenia zwierzęcego może być użyteczne zastosowanie specjalnych substancji zanurzeniowych i odczynników barwiących.

Hydrat chloralu (4.1.1):          Dzięki ostrożnemu podgrzaniu struktura komórek jest

                                  lepiej widoczna, ponieważ ziarna skrobi

                                  ulegają żelatynizacji i niepożądane składniki komórek

                                  są usuwane.

Olej parafinowy (4.1.2)           Składniki kości można łatwo rozpoznać w tym

                                  czynniku zanurzeniowym, ponieważ większość pustych

                                  przestrzeni pozostaje wypełniona powietrzem i mają

                                  wygląd czarnych dziur o wymiarach od 5 do 15 µm.

Odczynnik Bradforda (4.3.1)       Jest stosowany do wykrywania białek (typowy niebieski

                                  kolor). Rozcieńczyć wodą w stosunku około 1 : 4.

Jodyna/roztwór jodku potasu (4.3.2)  Jest stosowany do wykrywania skrobi (barwa

                                  niebieskofioletowa) i białka (barwa

                                  żółtopomarańczowa). W razie potrzeby rozcieńczyć.

Odczynnik Millona (4.3.3)         Po ostrożnym podgrzaniu składniki kostne przybierają

                                  barwę różową.

Odczynnik cystynowy (4.3.4.)      Po ostrożnym podgrzaniu składniki zawierające cystynę

                                  (włosy, pióra itp.) przybierają barwę czarnobrązową.

7. OBLICZANIE WYNIKÓW

W przypadku przeprowadzania oceny ilościowej składników pochodzenia zwierzęcego należy postępować zgodnie z poniższymi wskazaniami.

Obliczenia mogą być przeprowadzane tylko w przypadku, jeżeli składniki pochodzenia zwierzęcego zawierają fragmenty kości.

Fragmenty kości lądowych gatunków zwierząt stałocieplnych (tj. ssaków i ptaków) można odróżnić na mikroskopowych slajdach od różnych rodzajów kości ryb dzięki typowym rozstępom. Udział składników pochodzenia zwierzęcego w materiale próbki jest oceniany w oparciu o:

-   oznaczoną proporcję (% wagowy) fragmentów kości w zagęszczonym osadzie i

-   proporcję (% wagowy) kości w składnikach pochodzenia zwierzęcego.

Oznaczenie należy przeprowadzić na podstawie badania co najmniej trzech slajdów przedmiotowych (o ile to możliwe) i co najmniej pięciu pól na każdym slajdzie. W przypadku mieszanek paszowych zagęszczony osad z reguły zawiera nie tylko fragmenty kości zwierząt lądowych i rybich ości, ale również inne cząstki o dużym ciężarze właściwym, jak np. składniki mineralne, piasek, zdrewniałe fragmenty roślin.

7.1. Szacunkowa procentowa ilość fragmentów kości:

                                      S x c

% fragmentów kości zwierząt lądowych = ------,

                                        W

                                  S x d

% fragmentów ości i łusek rybich = ------,

                                    W

gdzie:

S -  masa osadu, w mg,

c -  współczynnik korekcyjny (%) oszacowanej części kości zwierząt lądowych w osadzie,

d -  współczynnik korekcyjny (%) oszacowanej ilości ości i łusek rybich w osadzie,

W -  masa materiału próbki poddanego sedymentacji, w mg.

7.2. Szacunkowa ilość składników pochodzenia zwierzęcego

Udział kości w produktach zwierzęcych może być bardzo zróżnicowany. (Procentowa ilość kości w przypadku mączek kostnych wynosi 50 do 60%, a w przypadku mączek mięsnych od 20 do 30%; w przypadku mączek rybnych ilość ości i łusek zależy od rodzaju i pochodzenia mączki mięsnej, zazwyczaj wynosi od 10 do 20%).

Jeżeli znany jest typ mączki pochodzenia zwierzęcego występującej w próbce, można oszacować jej zawartość:

szacunkowa zawartość składników pozyskanych od zwierząt

lądowych

      S x c

(%) = ------- x 100,

      W x f

                                      S x d

szacunkowa zawartość produktów z ryb = ------- x 100,

                                      W  x f

gdzie:

S -   masa osadu, w mg,

c -   współczynnik korekcyjny (%) oszacowanej części kości zwierząt lądowych w osadzie,

d -   współczynnik korekcyjny (%) oszacowanej ilości ości i łusek rybich w osadzie,

f -   współczynnik korekcyjny udziału kości w składnikach pozyskanych ze zwierząt w badanej próbce,

W -   masa materiału próbki użytego do sedymentacji, w mg.

8. WYRAŻANIE WYNIKÓW

W raporcie z badań wyniki przedstawić w następujący sposób:

8.1. Na tyle, na ile pozwalała obserwacja pod mikroskopem, nie stwierdzono w dostarczonej próbce obecności składników pochodzenia zwierzęcego (1).

8.2. Na tyle, na ile pozwalała obserwacja pod mikroskopem, w dostarczonej próbce stwierdzono obecność składników pochodzenia zwierzęcego (należy podać typ znalezionych składników, np. kości zwierząt lądowych, ości rybie, składniki mięsne).

W takim przypadku raport z wyników badania można, w razie potrzeby, przedstawić następująco:

8.2.1. Na tyle, na ile pozwalała obserwacja pod mikroskopem, w dostarczonej próbce stwierdzono obecność niewielkiej ilości składników pochodzenia zwierzęcego (wymienić jakich).

8.2.2. Zależnie od doświadczenia analityka, należy sformułować wynik w sposób następujący:

- na tyle, na ile pozwalała na to obserwacja pod mikroskopem, w dostarczonej próbce stwierdzono obecność składników pochodzenia zwierzęcego (wymienić jakich). Zawartość kości (rybich/zwierząt lądowych - w przypadku kości zwierząt lądowych ewentualnie wymienić fragmenty kości drobiu lub ssaków, (9.3) podać w procentach próbki lub podać procentową zawartość składników pochodzenia zwierzęcego, jeżeli obliczenia są dokonywane na podstawie procentowej zawartości kości i znany jest współczynnik korygujący f (w takim przypadku należy podać wartość współczynnika korygującego f),

- na tyle, na ile pozwalała obserwacja pod mikroskopem, w dostarczonej próbce stwierdzono obecność składników pochodzenia zwierzęcego w mierzalnych ilościach.

W odniesieniu do przypadków wymienionych w (8.2), (8.2.1) i (8.2.2), gdy stwierdzono obecność składników kości zwierząt lądowych, zamieścić w raporcie dodatkową klauzulę:

"Nie można wykluczyć, że wymienione wyżej składniki pochodzą od ssaków".

Klauzula ta nie jest potrzebna wówczas, gdy fragmenty kości zwierząt lądowych zostały zdefiniowane jako fragmenty kości drobiu lub ssaków (9.3).

9. OBJAŚNIENIA

9.1. W przypadku występowania wielu dużych cząstek w zagęszczonym osadzie zalecane jest przesianie osadu w celu uzyskania dwóch frakcji (tj. po zastosowaniu sita o wymiarach oczka 320 µm). Frakcja zawierająca duże cząstki może być badana w oleju parafinowym pod mikroskopem stereoskopowym w świetle przechodzącym. Frakcję zawierającą drobne cząstki należy badać pod mikroskopem sprzężonym.

9.2. Uzyskany zagęszczony osad (6.2) może w razie potrzeby być dodatkowo rozdzielony po zastosowaniu czynnika zagęszczającego o większej gęstości.

9.3. Zależnie od doświadczenia analityka, rozróżnienie składników pochodzących od ssaków lub drobiu może być dokonane na podstawie charakterystycznych cech histologicznych.

8.10. OZNACZANIE LOTNYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH

A. METODA MIKRODYFUZYJNA

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak, w paszach.

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowana wodą, a uzyskany roztwór klarowany i sączony. Lotne zasady azotowe są oddzielane metodą mikrodyfuzji przy zastosowaniu roztworu węglanu potasu, zbierane w roztworze kwasu bornego i miareczkowane kwasem siarkowym.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas trójchlorooctowy, roztwór 20% (m/V)

3.2. Wskaźnik: rozpuścić 33 mg zieleni bromokrezolowej i 65 mg czerwieni metylowej w 100 ml alkoholu etylowego o stężeniu 95 - 96% (m/V).

3.3. Kwas borny, roztwór: w kolbie miarowej o pojemności 1l rozpuścić 10 g kwasu bornego w 200 ml etanolu o stężeniu 95 - 96% (m/V) i 700 ml wody. Dodać 10 ml wskaźnika (3.2). Zamieszać i, jeśli to konieczne, doprowadzić barwę roztworu do jasnoczerwonej przez dodatek roztworu wodorotlenku sodu. 1 ml tego roztworu będzie pochłaniał maksymalnie 300 µg NH₃.

3.4. Węglan potasu, roztwór nasycony: rozpuścić 10 g węglanu potasu w 100 ml wrzącej wody. Schłodzić i przesączyć.

3.5. Kwas siarkowy o stężeniu 0,01 mol/l.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Mikser: około 35 do 40 rpm

4.2. Naczyńko Conwaya, szklane lub plastikowe

4.3. Mikrobiureta skalowana w zakresie 1/100 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć 10 g próbki, z dokładnością do 1 mg, do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), dopełnić do kreski wodą, energicznie wstrząsnąć i przesączyć przez karbowany sączek. Dodać przy użyciu pipety 1 ml roztworu kwasu borowego (3.3) do środkowej części naczyńka Conwaya i 1 ml przesączu próbki na obrzeże naczyńka. Przykryć częściowo zwilżoną smarem przykrywką. Dodać kroplami 1 ml nasyconego roztworu węglanu potasu (3.4) na obrzeże naczyńka i szybko zamknąć pokrywką tak, aby naczyńko było hermetyczne. Obracać ostrożnie naczyńkiem w płaszczyźnie poziomej, aby doprowadzić do zmieszania dwóch odczynników. Inkubować co najmniej 4 godziny w temperaturze pokojowej, lub 1 godzinę przy temperaturze 40°C. Miareczkować lotne zasady zaabsorbowane w kwasie bornym, stosując roztwór kwasu siarkowego 0,01 mol/l (3.5) przy użyciu mikrobiurety (4.3). Przeprowadzić ślepą próbę w ten sam sposób.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

1 ml H₂SO₄ o stężeniu 0,01 mol/l odpowiada 0,34 mg amoniaku. Przedstawić wynik w procentach wagowych.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie powinna przekraczać:

-   10% wartości względnej dla zawartości amoniaku mniejszych niż 1,0%;

-   0,1% wartości bezwzględnej dla zawartości amoniaku 1,0% lub wyższej.

8. OBJAŚNIENIA

Jeżeli zawartość amoniaku w próbce przekracza 0,6%, należy rozcieńczyć przesącz.

B. METODA DESTYLACYJNA

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak, w mączkach rybnych niezawierających mocznika. Metoda ma zastosowanie dla zawartości amoniaku mniejszej niż 0,25%.

2. ZASADA METODY

Próbka jest ekstrahowana wodą, a uzyskany roztwór klarowany i sączony. Lotne zasady azotowe są oddzielane w punkcie wrzenia poprzez dodatek tlenku magnezu i zbierane w określonej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany przy użyciu roztworu wodorotlenku sodu.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Kwas trójchlorooctowy, roztwór 20% (m/V)

3.2. Tlenek magnezu

3.3. Emulsja przeciw pienieniu się (np. silikonowa)

3.4. Kwas siarkowy, roztwór 0,05 mol/l

3.5. Wodorotlenek sodu, roztwór 0,1 mol/l

3.6. Czerwień metylowa, roztwór 0,3% (m/V) w alkoholu etylowym 95 - 96% (V/V)

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Mikser, około 35-40 rpm

4.2. Aparat do destylacji typu Kjeldahla

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć 10 g próbki, z dokładnością do 1 mg, do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), dopełnić do kreski wodą, energicznie wstrząsnąć i przesączyć przez karbowany sączek. Pobrać taką ilość klarownego przesączu, która odpowiada spodziewanej zawartości lotnych związków azotowych (objętość 100 ml jest zwykle wystarczająca). Rozcieńczyć do 200 ml, dodać 2 g tlenku magnezu (3.2) i kilka kropli emulsji przeciw pienieniu się (3.3). Roztwór powinien wykazywać alkaliczność wobec papierka lakmusowego. Dodać ponownie nieco tlenku magnezu (3.2). Destylować około 150 ml roztworu w aparacie Kjeldahla i zebrać destylat w kolbie Erlenmeyera zawierającej dokładnie odmierzoną objętość (od 25 ml do 50 ml) kwasu siarkowego 0,05 mol/l (3.4). W czasie destylacji chronić przed przegrzaniem. Gotować roztwór kwasu siarkowego przez dwie minuty, schłodzić i odmiareczkować nadmiar kwasu wodorotlenkiem sodu 0,1 mol/l (3.5) w obecności czerwieni metylowej (3.6). Przeprowadzić ślepą próbę w ten sam sposób.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

1 ml H₂SO₄ o stężeniu 0,05 mol/l odpowiada 1,7 mg amoniaku. Wynik podać w procentach wagowych próbki.

7. SPRAWDZENIE METODY

Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych w tej samej próbce nie powinna przekraczać 10% wartości względnej.

8.11. OZNACZANIE AKTYWNOŚCI INHIBITORA TRYPSYNY W PRODUKTACH SOJOWYCH

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania aktywności inhibitora trypsyny (TIA) w produktach sojowych. Aktywność inhibitora trypsyny jest wskaźnikiem stopnia toastowania tych produktów. Granica oznaczalności metody wynosi 0,5 mg/g.

2. OBJAŚNIENIA

Aktywność inhibitora trypsyny (TIA): Masa inhibitowanej trypsyny w warunkach oznaczania opisanych w niniejszej metodzie podzielona przez masę badanej próbki. Aktywność inhibitora trypsyny jest wyrażana w mg/g.

3. ZASADA METODY

Inhibitory trypsyny są ekstrahowane z próbki przy pH 9,5. Resztkowa aktywność trypsyny jest mierzona przez dodanie benzoylo-L-arginino-p-nitroanilidu (L-BAPA) jako substratu. Ilość uwolnionej p-nitroaniliny jest mierzona spektrometrycznie.

4. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

4.1. Woda, spełniająca co najmniej 3. stopień czystości

4.2. Roztwór wodorotlenku sodu, c(NaOH) = 0,01 mol/l

4.3. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 6 mol/l

4.4. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 1 mol/l

4.5. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,1 mol/l

4.6. Kwas chlorowodorowy, c(HCl) = 0,001 mol/l

4.7. Kwas octowy, c(CH₃COOH) = 5,3 mol/l

4.8. Dihydrat chlorku wapnia, CaCl₂ x 2H₂O

4.9. Roztwór chlorku wapnia w kwasie chlorowodorowym. Rozpuścić 735 mg dihydratu chlorku wapnia (4.8) w 1l kwasu chlorowodorowego (4.6) i ustalić pH. Wartość pH powinna wynosić 3,0 ±0,1.

4.10. Trypsyna bydlęca (art. Merck 24579 lub równoważny). Uwzględnić (6.3) dla pomiaru aktywności. Przechowywać w lodówce (5.3).

4.11. Roztwór podstawowy trypsyny. Pozwolić trypsynie (4.10) osiągnąć temperaturę pokojową. Rozpuścić 27,0 mg trypsyny w roztworze chlorku wapnia (4.9) w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml (5.1) i rozcieńczyć do kreski roztworem chlorku wapnia. Przechowywany w lodówce (5.3) roztwór może być stosowany najwyżej w ciągu 5 dni.

4.12. Roztwór roboczy trypsyny. Przenieść, przy użyciu pipety, 5 ml roztworu podstawowego trypsyny (4.11) do 100 ml kolby pomiarowej (5.1) i rozcieńczyć do kreski roztworem chlorku wapnia (4.9).

4.13. Benzoylo-L-arginino-p-nitroanilid (L-BAPA)

4.14. Tris(hydroksymetylo)aminometan (Tris)

4.15. Dimetylosulfotlenek (DMSO)

4.16. Bufor Tris - roztwór chlorku wapnia. Rozpuścić 6,05 g Tris (4.14) i 735 mg chlorku wapnia (4.8) w 900 ml wody w skalowanym cylindrze pomiarowym o pojemności 1l. Doprowadzić do pH 8,2 ±0,1 przy użyciu kwasu chlorowodorowego (4.3) i rozcieńczyć do 1l wodą.

4.17. Odczynnik L-BAPA. Przygotować odczynnik bezpośrednio przed użyciem. Rozpuścić 60 mg L-BAPA (4.13) w 1 ml DMSO (4.15) w kolbie pomiarowej o pojemności 100 ml (5.1) i rozcieńczyć do kreski roztworem buforu Tris w chlorku wapnia (4.16).

5. APARATURA I SPRZĘT

5.1. Kolby pomiarowe, o pojemności 100 ml

5.2. Kuwety, o drodze optycznej 10 mm

5.3. Lodówka z możliwością kontroli temperatury 4°C ± 3°C

5.4. Pehametr o dokładności 0,05 jednostki

5.5. Mikser do probówek

5.6. Spektrometr odpowiedni do pomiarów przy 410 nm

5.7. Stoper

5.8. Łaźnia wodna z pompą cyrkulacyjną, utrzymująca temperaturę 37°C ± 0,25°C

5.9. Rozdrabniacz, wyposażony w sito 0,5 mm

5.10. Wirówka, pracująca przy przyśpieszeniu kątowym około 1.500 g_n

5.11. Probówki wirówkowe

6. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Stosując rozdrabniacz (5.9), rozdrobnić reprezentatywną część próbki w taki sposób, aby ograniczyć do minimum jej nagrzanie. Rozdrobnioną próbkę dokładnie wymieszać.

Jeżeli wymagane jest sprawdzenie granicy powtarzalności (8.2), przeprowadzić dwa oznaczenia według (6.1) - (6.4) w warunkach powtarzalności.

6.1. Ekstrakcja próbki

Odważyć 1 g ± 0,001 g przygotowanej próbki do badań do kolby stożkowej o pojemności 100 ml i dodać 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (4.2). Dokładnie wstrząsnąć. Nastawić pH na 9,5 ± 0,1 przy użyciu kwasu chlorowodorowego ((4.4) i (4.5)). Spłukać elektrodę jak najmniejszą ilością wody. Zamknąć kolbę stożkową i pozostawić na noc (od 15 h do 24 h) w lodówce (5.3). Umieścić w lodówce wodę w ilości potrzebnej do rozcieńczania ekstraktów próbki.

Przenieść ekstrakt próbki do kolby pomiarowej o pojemności 100 ml (5.1), rozcieńczyć do kreski wodą z lodówki i zamieszać. Przechowywać kolbę w lodówce. Ekstrakt próbki zachowuje stabilność przez 1 dzień. Po sedymentacji w czasie 15 min ekstrakt próbki może być dalej rozcieńczany według potrzeb. Rozcieńczenia zależą od spodziewanej wartości TIA próbki i są wykonywane za pomocą wody o temperaturze pokojowej.

6.2. Rozcieńczenie ekstraktu próbki

Określić wartość TIA próbki i przygotować trzy różne rozcieńczenia ekstraktu próbki na podstawie schematu rozcieńczenia w tabeli 13 tak, aby spodziewany wynik pomiaru TIA (6.4) odpowiadał procentowemu zakresowi inhibicji w przedziale od 40% do 60% w co najmniej jednym z trzech rozcieńczeń.

Jeżeli żaden z trzech wyników nie zawiera się w tym przedziale, próba powinna być powtórzona.

6.3. Pomiar aktywności trypsyny roztworu roboczego

Sprawdzić aktywność każdej partii trypsyny (4.10). Różnica pomiędzy absorbancją roztworu roboczego (4.12) i absorbancją ślepej próby (A_r - A_br) powinna wynosić 0,380 ±0,050. Jeżeli ten warunek nie jest spełniony, sprawdzić jakość trypsyny (4.10). W razie konieczności pobrać nowy pojemnik trypsyny (4.10).

Odpipetować do probówek wirówkowych według poniższego schematu:

 

Składniki	Ślepa próba ml	Wzorzec ml
Odczynnik L-BAPA (4.17)	5	5
Woda (4.1)	3	3
Kwas octowy (4.7)	1	0

 

Zmieszać zawartości probówek przy użyciu miksera (5.5) i umieścić probówki w łaźni wodnej (5.8) na 10 min. Dodać:

 

Składnik	Ślepa próba ml	Wzorzec ml
Roztwór roboczy trypsyny (4.12)	1	1

 

Zmieszać zawartości probówek przy użyciu miksera i umieścić probówki wirówkowe ponownie w łaźni wodnej.

Po 10 min ± 5 s inkubacji dodać:

 

Składnik	Ślepa próba ml	Wzorzec ml
Kwas octowy (4.7)		1

 

Zmieszać zawartości probówek przy użyciu miksera.

Wirować probówki przez 10 min w wirówce (5.10) przy przyśpieszeniu kątowym około 1.500 g_n.

Zmierzyć absorbancję klarownych roztworów w odniesieniu do wody w spektrometrze (5.6) przy 410 nm, stosując kuwety 10 mm (5.2).

Roztwory pozostają stabilne przez najwyżej 2 h.

6.4. Pomiar aktywności inhibitora trypsyny

Odpipetować roztwory do probówek wirówkowych zgodnie z poniższym schematem. Przygotować dla każdego rozcieńczenia ekstraktu próbki (6.2) odpowiadającą ślepą próbę. Roztwory ekstraktu próbki i odpowiadające im ślepe próby powinny być poddane takiemu samemu postępowaniu, łącznie z wirowaniem.

 

Składniki	Ślepa próba ml	Wzorzec ml	Ślepa próba ml	Wzorzec ml
Odczynnik L-BAPA (4.17)	5	5	5	5
Rozcieńczony ekstrakt próbki (6.2)	0	0	1	1
Woda (4.1)	3	3	2	2
Kwas octowy (4.7)	1	0	1	0

 

Zmieszać zawartości probówek przy użyciu miksera (5.5) i umieścić probówki w łaźni wodnej (5.8) na 10 min. Dodać:

 

Składnik	Ślepa próba ml	Wzorzec ml	Ślepa próba ml	Wzorzec ml
Roztwór roboczy trypsyny (4.12)	1	1	1	1

 

Zmieszać zawartości probówek przy użyciu miksera i umieścić probówki ponownie w łaźni wodnej. Po inkubacji przez 10 min ±5 s dodać:

 

Składnik	Ślepa próba ml	Wzorzec ml	Ślepa próba ml	Wzorzec ml
Kwas octowy (4.7)	0	1	0	1

 

Zmieszać zawartości probówek przy użyciu miksera.

Wirować probówki przez 10 min w wirówce (5.10) przy przyśpieszeniu kątowym około 1.500 g_n.

Zmierzyć absorbancję klarownych roztworów w odniesieniu do wody w spektrometrze (5.6) przy 410 nm, stosując kuwety 10 mm (5.2).

Roztwory pozostają stabilne przez najwyżej 2 h.

7. OBLICZANIE WYNIKÓW

7.1. Procentowa wartość inhibicyjna roztworów ekstraktu próbki

Obliczyć procentową wartość inhibicyjną roztworów ekstraktu próbki według równania:

   (A_r - A_br)-(A_s - A_bs)

i = ---------------------- x 100%,

         (A_r - A_br)

gdzie:

i -    jest procentową wartością inhibicyjną, w %;

A_r -   jest absorbancją roztworu z wzorcem;

A_br -  jest absorbancją ślepej próby z wzorcem;

A_s -   jest absorbancją roztworu z próbką;

A_bs -  jest absorbancją ślepej próby z próbką.

7.2. Aktywność inhibitora trypsyny

Obliczyć aktywność inhibitora trypsyny, wyrażoną w mg związanej trypsyny na gram próbki, według równania:

       i     m₁ f₁ f₂

TIA = ---- x ----------,

     100%       m_o

gdzie:

TIA -  jest aktywnością inhibitora trypsyny, w mg/g;

i -    jest procentową wartością inhibicyjną, w %;

m_o -   jest masą badanej próbki, w g;

m₁ -   jest masą trypsyny, w mg;

f₁ -   jest rozcieńczeniem ekstraktu próbki ((100 ml x 100 ml)/V, gdzie V jest objętością z tabeli 13, w ml);

f₂ -  jest współczynnikiem przeliczeniowym (2,8 x 10^-4) opartym na czystości trypsyny (56%) i na rozcieńczeniu trypsyny według (4.11) i (4.12).

Wynik zaokrąglić do 0,1 mg/g.

8. SPRAWDZENIE METODY

8.1. Powtarzalność

Bezwzględna różnica pomiędzy dwoma niezależnymi, pojedynczymi wynikami oznaczeń otrzymanymi tą samą metodą w krótkim przedziale czasu, na identycznym badanym materiale, w tym samym laboratorium i przez tego samego laboranta oraz na tym samym wyposażeniu nie powinna wynosić więcej niż 5% przypadków wykraczających poza granicę powtarzalności r wskazaną w tabeli 12.

Tabela 12 - Granica powtarzalności (r) i odtwarzalności (R)

 

Próbka	Aktywność inhibitora trypsyny mg/g	r mg/g	R mg/g
Soja 1	1,53	0,18	1,11
Soja 2	1,30	0,09	2,11
Soja toastowana	2,08	1,03	1,88

 

8.2. Odtwarzalność

Bezwzględna różnica pomiędzy dwoma niezależnymi, pojedynczymi wynikami oznaczeń przeprowadzonych tą samą metodą, na identycznym badanym materiale, w różnych laboratoriach i przez różnych laborantów oraz na różnym wyposażeniu nie powinna wynosić więcej niż 5% przypadków wykraczających poza granicę odtwarzalności (R) wskazaną lub wynikającą z tabeli 12.

9. SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań powinno zawierać:

-   wszystkie informacje potrzebne do pełnej identyfikacji próbki;

-   metodę pobierania próbek, jeżeli jest znana;

-   zastosowaną metodę badania;

-   wynik badania.

Schemat rozcieńczenia podano w tabeli 13 poniżej. Rysunek 12 przedstawia przykład graficznego przedstawienia schematu rozcieńczenia.

Tabela 13 - Schemat rozcieńczenia

 

Spodziewana TIA mg/g	Teoretyczne rozcieńczenie wyrażone w ml ekstraktu próbki na 100 ml przy różnej procentowej wartości inhibicyjnej
	40%	50%	60%
0,5	61	76	91
1,0	30	38	45
1,5	20	25	30
2,0	15	19	23
2,5	12	15	18
3,0	10	13	15
3,5	8,6	11	13
4,0	7,6	9,5	11
4,5	6,7	8,5	10
5,0	6,0	7,6	9,1
6	5,0	6,3	7,6
7	4,3	5,4	6,5
8	3,8	4,7	5,7
9	3,4	4,2	5,0
10	3,0	3,8	4,5
11	2,7	3,4	4,1
12	2,5	3,2	3,8
13	2,3	2,9	3,5
14	2,2	2,7	3,2
15	2,0	2,5	3,0
16	1,9	2,4	2,8
17	1,8	2,2	2,7
18	1,7	2,1	2,5
19	1,6	2,0	2,4
20	1,5	1,9	2,3
25	1,2	1,5	1,8

 

grafika

rys. 12 Zależność pomiędzy aktywnością inhibitora trypsyny (TIA) i teoretycznym rozcieńczeniem próbki (w_t)

Rozdział 9

BADANIE INNYCH SKŁADNIKÓW I DODATKÓW PASZOWYCH

9.1. ILOŚCIOWE OZNACZENIE CHUDEGO MLEKA W PROSZKU W MIESZANKACH PASZOWYCH PRZEZ ENZYMATYCZNĄ KOAGULACJĘ PARAKAZEINY

1. CEL I ZAKRES

Ilościowe oznaczenie zawartości chudego mleka w proszku w mieszankach paszowych przez enzymatyczną koagulację parakazeiny.

Metoda służy do badania pasz pełnoporcjowych zawierających co najmniej 10% chudego mleka w proszku. W oznaczeniu mogą interferować większe ilości maślanki i/lub niektóre białka niepochodzące od mleka.

2. ZASADA METODY

2.1. Rozpuszczenie kazeiny zawartej w mieszance paszowej przez ekstrakcję roztworem cytrynianu sodowego.

2.2. Doprowadzenie do stężenia jonów wapniowych wymaganego do strącenia parakazeiny. Parakazeina jest otrzymywana przez dodatek podpuszczki do roztworu kazeiny.

2.3. Zawartość azotu w strąconej parakazeinie jest oznaczana metodą Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1). Ilość chudego mleka w proszku jest obliczana na podstawie minimalnej zawartości kazeiny w tym produkcie wynoszącej 27,5% (8.1).

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Należy stosować odczynniki czyste do analizy i wodę destylowaną lub o równoważnej czystości. Z wyjątkiem podpuszczki (3.5), wszystkie odczynniki i roztwory nie powinny zawierać substancji azotowych.

3.1. Cytrynian trisodu, dihydrat (roztwór 1% w/v)

3.2. Chlorek wapnia (roztwór 2 M). Odważyć 20,018 g CaCO₃ do porcelanowego naczynia o odpowiedniej pojemności (150 do 200 ml) lub do zlewki. Zalać wodą destylowana i umieścić na łaźni wodnej. Powoli dodawać 50 do 60 ml roztworu HCl (stężony HCl : woda = 1 : 1) aż do całkowitego rozpuszczenia węglanu. Utrzymywać na łaźni wodnej do wysuszenia CaCl₂ celem usunięcia nadmiaru HCl. Przenieść wodę destylowaną do 100 ml kolby miarowej, rozcieńczyć do kreski i zamieszać. Zmierzyć wartość pH, która powinna wynosić nie mniej niż 4. Przechowywać roztwór w lodówce.

3.3. Wodorotlenek sodu 0,1 N

3.4. Kwas chlorowodorowy 0,1 N

3.5. Podpuszczka cielęca w płynie (standardowa moc 1 : 10.000). Przechowywać w lodówce w temperaturze od 4 do 6°C.

3.6. Odczynniki wymagane przy ilościowym oznaczaniu azotu metodą Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1)

4. APARATURA I SPRZĘT

Typowe wyposażenie laboratoryjne, w tym:

4.1. Moździerz lub homogenizator

4.2. Waga analityczna

4.3. Wirówka (2000 do 3000 rpm) z probówkami wirówkowymi o pojemności 50 ml

4.4. Mieszadło magnetyczne z (10 do 15 mm) mieszadełkami

4.5. Zlewki o pojemności 150 do 200 ml

4.6. Kolby o pojemności 250 i 500 ml

4.7. Szklane leje o średnicy od 60 do 80 mm

4.8. Sączki bezpopiołowe do szybkiego sączenia, o średnicy 150 mm (S.S. 589², S.S. 595 1/2)

4.9. Pipety o różnej pojemności

4.10. Łaźnia wodna termostatowana przy temperaturze 37°C

4.11. Pehametr

4.12. Zestaw Kjeldahla do mineralizacji i destylacji z elementami łączącymi

4.13. Biureta 25 ml ze skalą

4.14. Tryskawka plastykowa na wodę destylowaną

4.15. Szpatułki stalowe nierdzewne

4.16. Termometry

4.17. Suszarka z termostatem

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Przygotowanie próbki

Rozdrobnić w moździerzu lub rozdrabniaczu od 10 do 20 g próbki w celu otrzymania homogennej mieszaniny.

5.2. Rozpuszczenie mleka w proszku i oddzielenie nierozpuszczalnej pozostałości.

5.2.1. Odważyć 1,000 ± 0,002 g homogennej mieszanki paszowej (5.1) bezpośrednio do 50 ml probówki wirówkowej. Dodać 30 ml roztworu cytrynianu trisodu (3.1) uprzednio podgrzanego do temperatury 45°C. Mieszać przy użyciu mieszadła magnetycznego co najmniej 5 minut.

5.2.2. Wirować przy 500 g (2.000 do 3.000 rpm) przez 10 minut i zdekantować klarowny roztwór do zlewki o pojemności 150 do 200 ml, zważając, aby nie nastąpiły straty materiału.

5.2.3. Przeprowadzić dwie kolejne ekstrakcje pozostałości według tego samego sposobu postępowania, łącząc uzyskane ekstrakty.

5.2.4. Gdy na powierzchni roztworu ekstraktu tworzy się warstwa oleju, schłodzić roztwór w lodówce do zestalenia tłuszczu i usunąć stałą warstwę tłuszczu przy użyciu szpatułki.

5.3. Koagulacja kazeiny enzymami podpuszczki

5.3.1. Ciągle mieszając, dodawać kroplami 3,4 ml nasyconego roztworu chlorku wapnia (3.2) do połączonego ekstraktu wodnego (około 100 ml). Doprowadzić do pH 6,4 - 6,5 roztworem NaOH (3.3) lub HCl (3.4). Umieścić w termostatowanej łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 15 do 20 minut w celu uzyskania równowagi soli. O uzyskaniu równowagi świadczy powstanie lekkiego zmętnienia.

5.3.2. Przenieść ciecz do jednej lub dwóch probówek wirówkowych i wirować przy 2000 g przez 10 minut w celu oddzielenia strąconego materiału. Przenieść klarowny roztwór, bez przemywania osadu, do jednej (lub dwóch) probówki wirówkowej.

5.3.3. Doprowadzić roztwór ponownie do temperatury 37°C. Mieszając ekstrakt, dodać kroplami 0,5 ml ciekłej podpuszczki (3.5). Koagulacja następuje w ciągu 1 do 2 minut.

5.3.4. Przenieść ponownie probówkę na łaźnię wodną i pozostawić w temperaturze 37°C na 15 minut. Usunąć próbkę z łaźni wodnej i rozbić koagulat przez wstrząsanie. Wirować przy 2.000 g przez 10 minut. Przesączyć roztwór znad koagulatu przez odpowiedni sączek bibułowy (sączek bezpopiołowy do szybkiego sączenia, Whatman No 541 lub równoważny) i zachować sączek. Przemyć osad w probówce wirówkowej 50 ml wody o temperaturze około 35°C przez wstrząsanie osadu. Wirować ponownie przy 2.000 g przez 10 minut. Przesączyć roztwór znad osadu przez uprzednio zachowany sączek.

5.4. Oznaczanie azotu w kazeinie

5.4.1. Po przemyciu przenieść ilościowo osad na sączek papierowy uzyskany według (5.3.4) za pomocą wody destylowanej. Przenieść sączek do kolby Kjeldahla. Oznaczyć azot metodą Kjeldahla (Rozdział 2, 2.1).

6. PRÓBA ZEROWA

6.1. Próbę zerową należy przeprowadzać regularnie, stosując bezpopiołowy sączek zwilżony w mieszaninie 90 ml (3.1) roztworu octanu sodowego, 1 ml nasyconego roztworu chlorku wapnia (3.2), 0,5 ml podpuszczki w płynie (3.5) i przemywanego wodą trzy razy po 15 ml przed mineralizacją metodą Kjeldahla, jak podano w (Rozdział 2, 2.1).

6.2. Objętość kwasu zużytego do miareczkowania ślepej próby należy odjąć od objętości kwasu (3.4) zużytej na miareczkowanie próbki.

7. TEST KONTROLNY

W celu przetestowania podanej wyżej procedury i odczynników przeprowadzić oznaczenie standardowej mieszanki paszowej o znanej zawartości mleka w proszku jak przedstawiono w badaniach porównawczych. Średni wynik dwóch pojedynczych oznaczeń nie powinien się różnić więcej niż o 1% od wyniku badań porównawczych.

8. WYRAŻANIE WYNIKÓW

Procentową zawartość mleka w proszku w mieszance paszowej obliczyć według poniższego wzoru:

     [ N * 6,38       ]

     [---------- * 100] - 2,81

     [   27,5         ]

%MMP = -------------------------,

              0,908

gdzie N oznacza procentową zawartość azotu parakazeiny; 27,5 jest współczynnikiem przeliczeniowym kazeiny na mleko w proszku; 2,81 i 0,908 są współczynnikami korekcyjnymi uzyskanymi po wykonaniu analizy regresji.

9. SPRAWDZENIE METODY

9.1. Powtarzalność

Co najmniej w 95% badanych przypadków analizy tej samej próbki, wykonywanej w dwóch powtórzeniach, przez tego samego operatora, w tym samym laboratorium, różnica pomiędzy powtórzeniami nie powinna być większa od 2,3 g mleka w proszku w 100 g mieszanki paszowej.

9.2. Odtwarzalność

Co najmniej w 95% badanych przypadków analizy tej samej próbki w dwóch laboratoriach różnica pomiędzy wynikami nie powinna być większa od 6,5 g mleka w proszku w 100 g mieszanki paszowej.

10. GRANICA TOLERANCJI

Wartość CrD₉₅ (krytyczna różnica; 95% granica istotności) jest obliczona według wzoru:

        1              [n - 1]

CrD₉₅ = ---- * ÖR² - r² [-----],

        Ö2             [  n  ]

w którym:

R -  odtwarzalność;

r -  powtarzalność.

Podwójne oznaczenie: CrD₉₅ = 4,5 g.

Gdy wyniki analizy chemicznej różnią się od deklarowanych nie więcej niż 4,5 g (podwójne oznaczenie), badana próbka mieszanki paszowej jest uważana za poprawną.

11. OBJAŚNIENIA

11.1. Dodatek dużych ilości niektórych białek niepochodzących od mleka, a zwłaszcza białek soi, może powodować uzyskanie zawyżonych wyników w rezultacie współstrącania z parakazeiną mleka w przypadku podgrzewania razem z mlekiem w proszku.

11.2. Dodatek maślanki może czasami powodować zaniżenie wyników ze względu na fakt, że tylko część nietłuszczowa jest oznaczana. Dodatek kwaśnej maślanki może dawać znacznie niższe wyniki ze względu na niecałkowite rozpuszczenie w roztworze cytrynianu.

11.3. Dodatek lecytyny w ilości 0,5% lub więcej może także powodować obniżenie wyników.

11.4. Wprowadzenie do mieszanki paszowej wysokoogrzewanego mleka w proszku może powodować zawyżenie wyników z uwagi na współstrącanie niektórych białek serwatkowych z parakazeiną mleka.

9.2. OZNACZANIE PODPUSZCZKOWEJ SERWATKI W PROSZKU W CHUDYM MLEKU W PROSZKU I W MIESZANINACH

1. CEL I ZAKRES

Metoda umożliwia stwierdzenie dodatku podpuszczkowej serwatki do:

(a)  chudego mleka w proszku,

(b)  mieszanin.

2. OBJAŚNIENIA

Zawartość podpuszczkowej serwatki w proszku jest definiowana jako procentowa zawartość oznaczona w warunkach opisanej procedury.

3. ZASADA METODY

Oznaczanie glikomakropeptydu A (GMPa) jest prowadzone metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej HPLC z fazą odwróconą. Ocena wyniku następuje poprzez porównanie ze standardowymi próbkami chudego mleka w proszku ze znaną i nieznaną zawartością serwatki w proszku. Wyniki wyższe od 1% (m/m) świadczą o obecności podpuszczkowej serwatki w proszku.

4. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Należy stosować odczynniki czyste do analizy i wodę destylowaną lub o równoważnej czystości. Acetonitryl powinien mieć czystość spektroskopową lub HPLC.

Odczynniki do HPLC z faza odwróconą.

41. Kwas trichlorooctowy, roztwór

Rozpuścić 240 g kwasu trichlorooctowego (CCl₃COOH) w wodzie i dopełnić do 1.000 ml.

4.2. Eluent A i B

Eluent A: 150 ml acetonitrylu (CH₃CN), 20 ml izopropanolu (CH₃CHOHCH₃) i 1,00 ml kwasu trifluorooctowego (CF₃COOH) wymieszać i dopełnić wodą do 1.000 ml.

Eluent B: 550 ml acetonitrylu, 20 ml izopropanolu i 1,00 ml kwasu trifluorooctowego wymieszać i dopełnić wodą do 1.000 ml. Przesączyć roztwory eluentów przez sączek membranowy o średnicy porów 0,45 µm.

4.3. Konserwacja kolumny

Po wykonaniu analiz kolumnę należy przepłukać eluentem B (gradientowo), a następnie przemyć acetonitrylem (gradientowe przez 30 minut). Kolumnę przechowywać w acetonitrylu.

4.4. Próbki wzorcowe

4.4.1. Chude mleko w proszku niezawierające podpuszczkowej serwatki w proszku (np. (0))

4.4.2. To samo chude mleko w proszku zafałszowane przez dodatek 5% (m/m) podpuszczkowej serwatki w proszku (np. (5)).

4.4.3. To samo chude mleko w proszku zafałszowane przez dodatek 50% (m/m) podpuszczkowej serwatki w proszku (np. (50)) * (*Podpuszczkowa serwatka w proszku o standardowym składzie, a także zafałszowane chude mleko w proszku jest dostępne w NIZO, Kernhemseweg 2, PO Box 20 - NL-6710 BA Ede. Materiały charakteryzujące się podobnymi wynikami do materiałów NIZO mogą być także zastosowane).

5. APARATURA I SPRZĘT

Aparatura do HPLC z faza odwróconą

5.1. Waga analityczna

5.2. Wirówka umożliwiająca osiągnięcie siły odśrodkowej 2.200 g, wyposażona w probówki wirówkowe o pojemności 50 ml

5.3. Wstrząsarka mechaniczna umożliwiająca wstrząsanie przy temperaturze 50°C

5.4. Mieszadło magnetyczne

5.5. Lejki szklane o średnicy około 7 cm

5.6. Sączki papierowe średnie, średnica około 12,5 cm

5.7. Szklany zestaw do sączenia wyposażony w sączki membranowe o średnicy porów 0,45 µm

5.8. Pipety z podziałką pozwalające na dozowanie 10 ml cieczy lub system pozwalający na dostarczenie 10,0 ml cieczy w 2 minuty.

5.9. Łaźnia wodna termostatowana, ustawiona na temperaturę 25 ± 0,5°C

5.10. Wyposażenie HPLC w składzie:

5.10.1. Pompa z podwójnym gradientem

5.10.2. Dozownik, ręczny lub automatyczny, o pojemności 100 µl

5.10.3. Kolumna Dupont Protein Plus (2 x 0,46 cm średnica wewnętrzna) lub podobna wypełniona krzemionką szerokoporowatą z fazą odwróconą

5.10.4. Termostat kolumny, ustawiony na temperaturę 35 ± 1°C

5.10.5. Detektor UV o zmiennej długości fali, umożliwiający pomiar przy 210 nm (w razie potrzeby można stosować wyższą długość fali aż do 220 nm), o czułości 0,02 A

5.10.6. Integrator umożliwiający pomiar wysokości piku

Praca przy temperaturze pokojowej kolumny jest możliwa przy założeniu, że fluktuacje temperatury nie będą większe od 1°C, gdyż w innym przypadku mogą wystąpić zbyt duże zmiany czasu retencji GMP_a.

6. POBIERANIE PRÓBEK

Pobrać próbki zgodnie z obowiązującymi zasadami. Przechowywać próbki w warunkach wykluczających zepsucie i jakiekolwiek zmiany składu.

7. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

7.1. Przygotowanie próbki do badań

Umieścić proszek w pojemniku o pojemności dwukrotnie większej od objętości proszku, zamykanym szczelną przykrywką. Zamknąć szybko pojemnik. Dobrze wymieszać proszek poprzez wielokrotne odwracanie pojemnika.

7.2. Próbka analityczna

Zważyć 2,000 ± 0,001 g próbki do badań i umieścić w probówce wirówkowej (5.2) lub w odpowiedniej zamykanej kolbie (50 ml).

7.3. Usuwanie tłuszczu i białek

7.3.1. Dodać 20 g gorącej wody (50°C) do próbki analitycznej. Rozpuścić proszek, wstrząsając na wstrząsarce mechanicznej (5.3) przez 5 minut lub przez 30 minut w przypadku badania kwaśnej maślanki. Umieścić probówkę na łaźni wodnej (5.9) i pozostawić do osiągnięcia temperatury 25°C.

7.3.2. Dodawać 10,0 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (4.1) o temperaturze 25°C w ciągu 2 minut, mieszając energicznie przy użyciu mieszadła magnetycznego (5.4). Umieścić probówkę na łaźni wodnej (5.9) i pozostawić przez 60 minut.

7.3.3. Wirować (5.2) przez 10 minut przy 2200 g lub przesączyć przez sączek (5.6), odrzucając pierwsze 5 ml przesączu.

7.4. Oznaczenie chromatograficzne

7.4.1. Przeprowadzić analizę HPLC z fazą odwróconą opisaną poniżej. Obecność kwasowej maślanki w proszku może powodować zawyżenie wyników. Analiza HPLC z fazą odwróconą eliminuje taką możliwość.

7.4.2. Przed wykonaniem analizy chromatograficznej HPLC z fazą odwróconą należy zoptymalizować warunki gradientu. Czas retencji 26 ± 2 minut dla GMP_a jest czasem optymalnym w systemach gradientowych z martwą objętością około 6 ml (całkowita objętość od punktu, w którym łączą się rozpuszczalniki, do pętli dozownika). Gradientowe systemy z niższą martwą objętością (np. 2 ml) umożliwiają uzyskanie optymalnego czasu retencji w 22 minuty.

Pobrać roztwory wzorcowych próbek (4.4) bez podpuszczkowej serwatki w proszku i z zawartością 50% podpuszczkowej serwatki w proszku.

Dozować 100 µl klarownego roztworu nad osadem po odwirowaniu lub przesączu (7.3.3) na kolumnę HPLC, ustawiając system tak, aby otrzymać warunki gradientowe podane w tabeli 14.

Tabela 14. Poszukiwane gradientowe warunki dla optymalizacji chromatografii

 

Czas (minuty)	Przepływ (ml/min)	%A	%B	Krzywa
Start	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	liniowa
32	1,0	10	90	liniowa
37	1,0	10	90	liniowa
42	1,0	90	10	liniowa

 

Porównanie dwóch chromatogramów pozwoli na ujawnienie lokalizacji piku GMP_a.

Wykorzystując podany niżej wzór, można obliczyć początkowy skład rozpuszczalnika w przypadku pracy w warunkach zwykłego gradientu (7.4.3):

% B = 10 - 2,5 + (13,5 + (RTgmpA - 26)/6) x 30/27

% B = 7,5 + (13,5 (RTgmpA - 26)/6) x 1,1l,

gdzie:

RTgmpA -     czas retencji GMP_a w poszukiwanym gradiencie,

10 -         początkowy % B poszukiwanego gradientu,

2,5 -        % B w punkcie środkowym minus % B w początku zwykłego gradientu,

13,5 -       średni czas poszukiwanego gradientu,

26 -         wymagany czas retencji GMP_a,

6 -          współczynnik nachylenia poszukiwanego i zwykłego gradientu,

30 -         % B w początku minus % B przy 27 minucie poszukiwanego gradientu,

27 -         czas przebiegu poszukiwanego gradientu.

7.4.3. Pobranie roztworów badanej próbki

Dozować dokładnie 100 µl supernatantu lub przesączu (7.3.3) na kolumnę chromatograficzną HPLC, pracując przy przepływie 1 ml roztworu eluentu (4.2) na minutę. Skład eluentu na początku analizy otrzymujemy z (7.4.2). Zwykle zawiera się w A : B = 76 : 24 (4.2). Bezzwłocznie po zadozowaniu włączyć liniowy gradient, który daje o 5% wyższy udział B po 27 minutach. Następnie włączyć liniowy gradient, który pozwoli na uzyskanie 90% B w 5 minut. Ten skład jest utrzymywany przez 5 minut, po czym skład zmienia się poprzez liniowy gradient przez 5 minut do początkowego składu. Zależnie od wewnętrznej objętości układu pompującego, następne dozowanie może być wykonane 15 minut po uzyskaniu początkowych warunków.

1.   Czas retencji glikomakropeptydu powinien wynosić 26 ± 2 minuty. To może być osiągnięte przez zmianę początkowych i końcowych warunków pierwszego gradientu. Jednakże różnica w % B dla początkowych i końcowych warunków pierwszego gradientu musi pozostawać 5% B.

2.   Eluenty powinny być wystarczająco odgazowane i powinny być w takim stanie. Jest to warunek istotny dla właściwego funkcjonowania gradientowego systemu pomp. Odchylenie standardowe czasu retencji piku GMP_a powinno być mniejsze niż 0,1 minuty (n = 10).

3.   Po każdych pięciu próbach należy dozować próbkę referencyjną (5) i użyć do obliczenia nowego współczynnika R (8.1.1).

7.4.4. Wyniki chromatograficznej analizy badanej próbki (E) są otrzymane w formie chromatografu, na którym pik GMP_a jest identyfikowany na podstawie czasu retencji wynoszącego około 26 minut.

Integrator (5.10.6) automatycznie oblicza wysokość H piku GMP_a. Linia podstawy powinna być wyznaczona dla każdego chromatogramu. Analiza lub integracja powinny być powtórzone, gdy linia podstawy jest niewłaściwie położona.

Ważne jest, aby zbadać każdy chromatogram przed ilościową interpretacją w celu wykrycia jakichkolwiek nieprawidłowości w funkcjonowaniu aparatury lub kolumny lub pochodzenia i natury analizowanej próbki. W przypadku problemów należy powtórzyć analizę.

7.5. Kalibracja

7.5.1. Zastosować dokładnie procedurę opisaną od (7.2) do (7.4.4) do próbek wzorcowych ((4.4.1) i (4.4.2)). Badać świeżo przygotowane roztwory, ponieważ GMP ulega degradacji w środowisku 8% kwasu trichlorooctowego w temperaturze pokojowej. Przy temperaturze 4°C roztwór pozostaje stabilny przez 24 godziny. W przypadku długich serii analiz pożądane jest chłodzenie próbek w automatycznym podajniku. Opis w (7.4.2) może być pominięty, jeżeli % B przy początkowych warunkach jest znany z poprzedniej analizy. Chromatogram próbki referencyjnej (5) powinien być analogiczny do podanego na rys. 13. Na tym rysunku pik GMP_a składa się z dwóch małych pików. Istotne jest, aby otrzymać podobny rozdział.

7.5.2. Przed chromatograficznym oznaczeniem próbki wstrzyknąć 100 µl standardowej próbki bez podpuszczkowej serwatki (0) (4.4.1).

Chromatogram nie powinien wykazywać piku w miejscu retencji GMP_a.

7.5.3. Oznaczyć współczynnik R przez dozowanie tej samej objętości przesączu (7.5.1), jak podano w przypadku próbki.

8. OBLICZANIE WYNIKÓW

8.1. Metoda obliczeń

8.1.1. Obliczanie współczynnika R

Pik GMP: R - W/H,

gdzie:

R -   współczynnik odpowiedzi piku GMP,

H -   wysokość piku GMP,

W -   ilość serwatki w standardowej próbce (5).

8.2. Obliczanie procentowej zawartości podpuszczkowej serwatki w proszku w próbce

W(E) = R x H(E),

gdzie:

W(E) - procentowa (m/m) zawartość podpuszczkowej serwatki w próbce (E),

R - współczynnik odpowiedzi piku GMP (8.1.1),

H(E) - wysokość piku GMP próbki (E).

Jeżeli W(E) jest większe niż 1% i różnica pomiędzy czasem retencji próbki badanej i standardowej (5) jest mniejsza niż 0,2 minuty, uważa się, że serwatka podpuszczkowa jest obecna w próbce.

9. SPRAWDZENIE METODY

9.1. Powtarzalność

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych równolegle lub tuż po sobie przez tego samego analityka, przy zastosowaniu tej samej aparatury na identycznym materiale nie powinna być większa od 0,2% m/m.

9.2. Odtwarzalność

Nie była oznaczona.

9.3. Liniowość

W zakresie od 0 do 16% zawartości serwatki podpuszczkowej powinno się uzyskać zależność liniową przy współczynniku korelacji > 0,99.

9.4. Interpretacja

Uważa się, że serwatka jest obecna, gdy wynik uzyskany w (8.2) jest większy od 1% m/m, a czas retencji piku GMP_a różni się mniej niż 0,2 minuty od czasu retencji próbki wzorcowej (5).

grafika

rys. 13 Chromatogram próbki referencyjnej

9.3. WYKRYWANIE SKROBI W CHUDYM MLEKU W PROSZKU, DENATUROWANYM MLEKU W PROSZKU I W MIESZANKACH PASZOWYCH

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do wykrywania skrobi, która jest stosowana jako wskaźnik w produktach denaturowanego mleka w proszku. Granica wykrywalności metody wynosi około 0,05 g skrobi w 100 g próbki.

2. ZASADA METODY

Zasada metody opiera się na reakcjach wykorzystywanych w jodometrii:

- wiązanie przez koloidy wolnego jodu w roztworze wodnym,

- absorpcja na micellach skrobi i tworzenie barwy.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

3.1. Roztwór jodu

-   jod                    1 g,

-   jodek potasu           2 g,

-   woda destylowana       100 ml.

4. APARATURA I SPRZĘT

4.1. Waga analityczna

4.2. Łaźnia wodna

4.3. Probówki testowe, 25 mm x 200 mm

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Odważyć 1 g próbki i przenieść do probówki (4.3).

Dodać 20 ml wody destylowanej i wstrząsać w celu dyspersji próbki.

Umieścić na wrzącej łaźni wodnej (4.2) i pozostawić przez 5 minut.

Zdjąć z łaźni i schłodzić do temperatury pokojowej.

Dodać 0,5 ml roztworu jodu (3.1), wstrząsnąć i obserwować utworzoną barwę.

6. WYRAŻANIE WYNIKÓW

Niebieskie zabarwienie wskazuje na obecność skrobi w próbce.

Gdy próbka zawiera modyfikowaną skrobię, powstała barwa nie musi być niebieska.

7. OBJAŚNIENIA

Barwa, intensywność zabarwienia i potwierdzona mikroskopowo obecność skrobi mogą się zmieniać zależnie od natury skrobi (np. kukurydzianej lub ziemniaczanej) i sposobu modyfikacji skrobi w próbce.

W obecności modyfikowanej skrobi tworzy się barwa fioletowa, czerwona lub brązowa, zależnie od stopnia modyfikacji krystalicznej struktury skrobi.

9.4. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI KWASOWEJ MAŚLANKI W PROSZKU

1. CEL I ZAKRES

Metoda służy do oznaczania wilgotności w kwasowej maślance w proszku do celów paszowych.

2. ZASADA METODY

Próbka jest suszona pod próżnią. Utrata masy jest oznaczana wagowo.

3. APARATURA I SPRZĘT

3.1. Waga analityczna

3.2. Suche pojemniki z niekorodującego metalu lub szklane z pokrywkami zapewniającymi szczelne zamknięcie; powierzchnia robocza pojemnika powinna zapewniać rozłożenie próbki 0,3 g/cm².

3.3. Suszarka próżniowa z kontrolowaną temperaturą, wyposażona w pompę olejową i w urządzenie do wprowadzania gorącego suchego powietrza, lub czynnik suszący (np. tlenek wapnia)

3.4. Eksykator z efektywnym czynnikiem suszącym

3.5. Suszarka z wentylacją, termostatowana przy temperaturze 102 ± 2°C

4. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

Ogrzewać pojemnik (3.2) z pokrywką w suszarce (3.5) co najmniej przez godzinę. Zamknąć pojemnik pokrywką, szybko przenieść do eksykatora (3.4), schłodzić do temperatury pokojowej i zważyć z dokładnością do 0,5 mg.

Zważyć pojemnik (3.2) z pokrywką z dokładnością do 0,5 mg. Odważyć do zważonego pojemnika, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równomiernie rozsypać. Umieścić pojemnik bez pokrywki w suszarce próżniowej (3.3) ogrzanej do temperatury 83°C. Aby zapobiec spadkowi temperatury, wstawić pojemnik tak szybko jak to możliwe.

Ustawić ciśnienie na 100 Torr (13,3 kPa) i ogrzewać przez cztery godziny pod tym ciśnieniem, w przepływie gorącego suchego powietrza lub stosując czynnik suszący (około 300 g na 20 próbek). W ostatnim przypadku odłączyć pompę próżniową, gdy założone ciśnienie zostanie osiągnięte. Czas suszenia należy liczyć od momentu, gdy temperatura w suszarce osiągnie 83°C. Ostrożnie doprowadzić ciśnienie w suszarce do atmosferycznego. Otworzyć suszarkę, szybko nałożyć pokrywkę na pojemnik, wyjąć pojemnik z suszarki, pozostawić do schłodzenia przez 30 do 45 minut w eksykatorze (3.4) i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć dodatkowo przez 30 minut w suszarce próżniowej (3.3) przy temperaturze 83°C i ponownie zważyć. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1% wilgotności.

5. OBLICZANIE WYNIKÓW

         100

(E - m) x ----,

          E

gdzie:

E -  początkowa masa badanej próbki, w g,

m -  masa próbki po wysuszeniu, w g.

6. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

6.1. Granica powtarzalności

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tego samego materiału, przeprowadzonych w krótkim przedziale czasu, przez operatora stosującego tę samą aparaturę, nie może przekraczać 0,4 g wody/100 g kwasowej maślanki w proszku.

6.2. Granica odtwarzalności

Różnica pomiędzy wynikami dwóch oznaczeń tego samego materiału, przeprowadzonych przez operatorów w różnych laboratoriach, stosujących różną aparaturę, nie może przekraczać 0,6 g wody/100 g kwasowej maślanki w proszku.

9.5. OZNACZANIE BHT, BHA I EQ

1. CEL I ZAKRES

Podano metodę oznaczania BHT (3,5-di-t-butylo-4-hydroksytoluen), BHA (2 i 3-t-butylo-4-hydroksyanizol) i EQ (2,2,4-trimetylo-6-etoksy-1,2-dihydrochinolina) w wieloskładnikowych preparatach przeciwutleniających, premiksach, mączkach zwierzęcych, tłuszczach, koncentratach i mieszankach paszowych.

2. ZASADA METODY

Zasada metody polega na ekstrakcji przeciwutleniaczy z badanej próbki za pomocą rozpuszczalników organicznych i oznaczaniu ich techniką chromatografii gazowej.

3. ODCZYNNIKI I ROZTWORY

Podczas badań, jeżeli nie zaznaczono inaczej, należy stosować wyłącznie odczynniki cz.d.a. oraz wodę podwójnie destylowaną lub wodę o równoważnej czystości.

3.1. Metanol

3.2. N-heksan

3.3. Siarczan(VI) sodu, bezwodny

3.4. Acetonitryl

3.5. Difenyl (wzorzec wewnętrzny), roztwory w metanolu o stężeniu 1 mg/ml i 10mg/ml

3.6. BHT, BHA i EQ, roztwory wzorcowe w metanolu o stężeniu 1 mg/ml

3.7. Sączki z bibuły, średnie

3.8. Eter etylowy

3.9. Mikrokolumna z filtrem typu SEP-PACK C₁₈

4. APARATURA I SPRZĘT

Stosuje się następującą aparaturę i sprzęt:

4.1. Waga analityczna

4.2. Wstrząsarka laboratoryjna

4.3. Chromatograf gazowy z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym, integratorem lub rejestratorem

4.4. Odparowywacz obrotowy próżniowy

4.5. Szkło typowe laboratoryjne

4.6. Strzykawka o pojemności 10 ml

5. SPOSÓB POSTĘPOWANIA

5.1. Ekstrakcja przeciwutleniaczy z mączek zwierzęcych, koncentratów i mieszanek paszowych

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 20 g próbki i wyekstrahować tłuszcz surowy według metody (Rozdział 2, 2.8). Zagęścić ekstrakt do objętości około 5 ml na obrotowym odparowywaczu próżniowym i przenieść ilościowo do 10 ml probówki z korkiem. Kolbę przemyć dwukrotnie 2 ml eteru etylowego i roztwory z przemycia dołączyć do probówki. Z połączonych w probówce ekstraktów odparować eter pod wyciągiem na łaźni wodnej, do ciekłej pozostałości tłuszczowej dodać 2 ml acetonitrylu. Dalej postępować jak w (5.2).

5.2. Ekstrakcja przeciwutleniaczy z olejów i tłuszczów

Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 1 g oleju lub roztopionego tłuszczu i umieścić w probówce z korkiem, o pojemności 10 ml. Dodać 2 ml acetonitrylu. Zawartość energicznie wstrząsać. Po rozdzieleniu faz ekstrakt oddzielić za pomocą strzykawki i powtórzyć ekstrakcję ponownie taką samą ilością acetonitrylu. Ekstrakty połączyć w strzykawce i przefiltrować przez SEP-PACK C₁₈ nawilżony wcześniej acetonitrylem. Zatrzymane przeciwutleniacze wyeluować z filtru SEP-PACK za pomocą dalszych 4 ml acetonitrylu do kolby z okrągłym dnem, o pojemności 25 ml. Następnie dodać taką ilość wzorca wewnętrznego o stężeniu 1 mg/ml, aby ilość difenylu była zbliżona do oczekiwanej zawartości przeciwutleniacza w próbce. Roztwór odparować do sucha w obrotowym odparowywaczu próżniowym, w temperaturze do 40°C. Pozostałość rozpuścić w 1 ml n-heksanu. Na kolumnę chromatografu dozować od 1 µl do 10 µl roztworu.

5.3. Ekstrakcja przeciwutleniaczy z premiksów paszowych

Odważyć, z dokładnością do 0,01 g, około 10 g odważkę premiksu i wsypać do kolby stożkowej o pojemności 200 ml. Dodać 50 ml metanolu i wstrząsać zawartość przez 30 min. Następnie zawartość przesączyć do rozdzielacza o pojemności 250 ml zawierającego 50 ml wody, przemyć sączek 50 ml metanolu i ekstrahować zawartość rozdzielacza trzykrotnie n-heksanem porcjami po 25 ml. Ekstrakty przesączyć przez bezwodny siarczan(VI) sodu umieszczony na sączku z bibuły. Sączek przemyć 10 ml n-heksanu i do filtratów dodać taką ilość roztworu difenylu w metanolu (wzorca wewnętrznego), aby ilość difenylu była zbliżona do oczekiwanej zawartości oznaczanych przeciwutleniaczy. Zawartość odparować do sucha na obrotowym odparowywaczu próżniowym w temperaturze do 40°C, pozostałość rozpuścić w 1 ml n-heksanu. Na kolumnę dozować od 1 µl do 10 µl uzyskanego roztworu.

5.4. Ekstrakcja przeciwutleniaczy z wieloskładnikowych preparatów

W zależności od rodzaju preparatu ekstrakcję przeprowadzić w następujący sposób:

- Ekstrakcja z preparatów ciekłych. Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 0,5 g preparatu ciekłego i umieścić w kolbie pomiarowej o pojemności 10 ml. Do kolby dodać taką objętość roztworu difenylu w metanolu (wzorca wewnętrznego o stężeniu 10 mg/ml), aby ilość difenylu była zbliżona do oczekiwanej zawartości przeciwutleniaczy w próbce. Zawartość kolby uzupełnić do kreski metanolem. Na kolumnę chromatografu dozować od 1 µl do 5 µl roztworu.

- Ekstrakcja z preparatów sypkich. Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, około 1 g preparatu i umieścić w probówce z korkiem. Dodać taką objętość roztworu difenylu w metanolu (wzorca wewnętrznego o stężeniu 1 mg/ml), aby ilość difenylu była zbliżona do oczekiwanej zawartości przeciwutleniaczy w próbce. Zawartość probówki wstrząsać przez 30 min, a następnie odwirować. Na kolumnę chromatografu dozować od 1 µl do 5 µl roztworu.

5.5. Warunki pracy chromatografu

Podane warunki należy traktować jako przykładowe i tak dostosować do modelu chromatografu, aby uzyskać pełny rozdział BHT, BHA i EQ oraz difenylu jako wzorca wewnętrznego.

-   kolumna szklana pakowana o długości 2 m i średnicy 3 mm < a < 4 mm wypełniona: Gas-chrom Q 80/100 mesh z 10% Silar 5CP,

-   temperatura kolumny - 210°C,

-   temperatura dozownika i detektora - 250°C,

-   gaz nośny - azot, przepływ 30 ml/min

5.6. Kalibracja

W celu przeprowadzenia kalibracji do probówki zamykanej korkiem wprowadzić po 1 ml roztworów wzorcowych BHT, BHA, EQ oraz roztworu difenylu w metanolu (wzorzec wewnętrzny o stężeniu 1 mg/ml). Po wymieszaniu zawartości dozować na kolumnę chromatografu 5 µl uzyskanego roztworu. Po przeprowadzeniu rozdziału chromatograficznego z uzyskanego chromatogramu określić powierzchnie plików przeciwutleniaczy oraz difenylu, a następnie obliczyć współczynniki kalibracji K_p dla poszczególnych przeciwutleniaczy według wzoru:

     S_p * M_ww

K_p = ----------,

     S_ww * M_p

w którym:

S_p -    powierzchnia piku przeciwutleniacza,

M_ww -   masa wzorca wewnętrznego wprowadzonego do mieszaniny roztworów wzorcowych przeciwutleniaczy, w µg,

S_ww -   powierzchnia piku wzorca wewnętrznego,

M_p -    masa przeciwutleniacza w roztworze wzorcowym, w µg.

Po przeprowadzeniu od trzech do pięciu rozdziałów chromatograficznych dla każdego przeciwutleniacza należy wyliczyć średnie współczynniki kalibracji.

6. OBLICZANIE WYNIKÓW

Na podstawie chromatogramu badanej próbki wyliczyć zawartość oznaczonego przeciwutleniacza X, w mg/kg, w próbce według wzoru:

      S_p * M_ww

X = --------------,

    S_ww * K_p * m

w którym:

S_p -    powierzchnia piku przeciwutleniacza,

M_ww -   masa wzorca wewnętrznego wprowadzonego do próbki, w µg,

S_ww -   powierzchnia piku wzorca wewnętrznego,

K_p -    średni współczynnik kalibracji dla danego przeciwutleniacza,

m -     odważka próbki wzięta do analizy, w g.

7. WYNIK KOŃCOWY

Za wynik końcowy należy przyjąć średnią arytmetyczną wyników dwóch równoległych oznaczeń różniących się nie więcej niż o 10% wartości błędu względnego.

________

¹⁾    W celu suszenia ziarna zbóż, mąki, kasz i mączek należy stosować suszarki, które osiągają temperaturę 131°C w czasie poniżej 45 minut, przy maksymalnej liczbie próbek poddawanych równoczesnemu suszeniu. Suszarka powinna być wentylowana w taki sposób, aby po dwóch godzinach suszenia maksymalnej liczby próbek wyniki nie różniły się więcej niż o 0,15% w porównaniu do wyników uzyskanych po czterech godzinach suszenia.

²⁾    W przypadkach gdy tłuszcz lub olej muszą być poddane dalszym badaniom jakościowym, należy zastąpić pumeks kuleczkami szklanymi.

³⁾    Handlowym odpowiednikiem jest BRIJ 35. Informację tę podano dla wygody użytkownika niniejszej metody i nie służy ona propagowaniu tego produktu.

⁴⁾    Handlowym odpowiednikiem jest Aminex A5. Informację tę podano dla wygody użytkownika niniejszej metody i nie służy ona propagowaniu tego produktu.

⁵⁾    Zielonki (świeże lub suszone) mogą zawierać duże ilości krzemionki, która zatrzymuje pierwiastki śladowe i którą należy usunąć. W przypadku analizy takich pasz należy zastosować następujące, zmodyfikowane postępowanie.

Doprowadzić postępowanie według (5.1.1.1.) do etapu sączenia. Przemyć dwukrotnie wrzącą wodą sączek zawierający nierozpuszczalną pozostałość i umieścić w platynowym tyglu (4.3). Spopielać w piecu muflowym w temperaturze poniżej 550°C do momentu całkowitego zaniku cząstek węgla. Pozostawić do schłodzenia i dodać kilka kropli wody, 10 do 15 ml kwasu fluorowodorowego (3.4), a następnie odparować do sucha w temperaturze około 150°C. Jeżeli krzemionka widoczna jest nadal w pozostałości, powtórnie rozpuścić pozostałość w kilku ml kwasu fluorowodorowego (3.4) i odparować do sucha. Dodać 5 kropli kwasu siarkowego (3.5) i ogrzewać aż do zaniku białych dymów. Po dodaniu 5 ml kwasu chlorowodorowego o stężeniu 6 mol/l (3.2) i około 30 ml wody podgrzać, przesączyć roztwór do kolby miarowej o pojemności 250 ml i dopełnić do kreski wodą (stężenie HCl około 0,5 mol/l). Kontynuować oznaczanie od (5.1.2).

⁶⁾    - 1 mg wirginiamycyny odpowiada 1.000 jednostek angielskich (UK).

⁷⁾    - Inne metody mogą być zastosowane w przypadku, gdy pozwalają uzyskać podobną zawiesinę bakteryjną.

⁸⁾    - Inne dostępne w handlu pożywki lub podobne kompozycje dające te same wyniki mogą być zastosowane.

⁹⁾    - 1 mg Zn-bacytracyny paszowej odpowiada 42 międzynarodowym jednostkom (i.u.).

¹⁰⁾   Inne metody, pozwalające uzyskać podobną zawiesinę bakteryjną, mogą być stosowane.

¹¹⁾   Inne, dostępne w handlu pożywki o podobnym składzie, dające takie same wyniki, mogą być zastosowane, np. oxoid antibiotic medium 1 (CM 327) z dodatkiem agaru oxoid Nr 3 (L 13).

¹²⁾   Inne dostępne w handlu pożywki o podobnym składzie, dające takie same wyniki, mogą być zastosowane, np. oxoic antibiotic medium 2 (CM 335) z dodatkiem agaru Nr 3 (L 13).

₁₃₎   - 1 mg spiramycyny odpowiada 3.200 międzynarodowym jednostkom (IU), litery "S" i "U" odnoszą się do średnic stref zahamowania.

¹⁴⁾   1 mg soli sodowej monenzyny odpowiada 1.000 UK jednostek.

¹⁵⁾   Można stosować inne metody pod warunkiem, że uzyskuje się podobną zawiesinę bakteryjną etanolu; zamieszać. Trwałość zawiesiny do 5 miesięcy.

¹⁶⁾   Można zastosować gotową pożywkę o podobnym składzie i dającą takie same rezultaty.